Projets et candidats lauréats

Le VIH responsable de la pandémie de SIDA trouve son origine dans des transmissions inter-espèces de lentivirus simiens (SIV). L’identification des interfaces VIH-cellules qui sont importantes in vivo est un objectif majeur pour la lutte contre le VIH/SIDA. Deux gènes, SAMD9 et SAMD9L, étaient des candidats intéressants parce qu’ils (i) appartiennent à la même famille de gènes, qui a évolué dans une « course aux armements » moléculaire chez les mammifères, (ii) sont des facteurs de restriction des poxvirus et ont été trouvés dans un screen CRISPR-VIH, et (iii) sont impliqués dans des maladies génétiques inflammatoires (SAAD/ATXPC). Dans des travaux récents et en cours, nous avons découvert que SAMD9L restreint la réplication du VIH et des lentivirus, tandis que SAMD9 a un effet proviral sur le VIH-1 (Legrand et al bioRxiv 2023). Nous avons identifié que l’inhibition par SAMD9L se situe au niveau de l’étape de traduction des protéines virales, avec une forte restriction des souches Transmitted/Founders de personnes VIH-1+. Nous avons également montré que SAMD9L inhibe les lentivirus, mais pas le rétrovirus MLV, ni deux virus à ARN (MOPV, VSV). En outre, nous avons identifié un site actif de type Schlafen (SLFN) nécessaire à l’activité anti-VIH de SAMD9L. En testant un variant SAMD9L de patients SAAD/ATXPC, nous avons déterminé que les fonctions cellulaires et délétères dépendent également de ce site actif. Enfin, nous avons proposé un modèle dans lequel la répression traductionnelle de SAMD9L dépendrait du biais d’usage des codons, reliant sa fonction cellulaire et l’immunité spécifique au virus.

Dans d’autres analyses préliminaires, nous avons réalisé des analyses génomiques et évolutives, aux niveaux inter- et intra-espèces, mettant en évidence des adaptations exceptionnelles et des pertes de gènes dans les populations d’hominidés proches de l’homme et qui sont dépourvues d’infections naturelles par le SIV. Nos premiers tests fonctionnels de ces variants naturels suggèrent que ces polymorphismes pourraient potentialiser l’effet antiviral de SAMD9L, constituant des « super-restricteurs » du VIH-1.

Pendant ce financement, nous caractériserons la fonction, ainsi que l’évolution génomique et fonctionnelle, de SAMD9/9L chez les primates en ce qui concerne le VIH. Tout d’abord, nous identifierons et caractériserons les déterminants et mécanismes responsables des effets opposés de SAMD9/9L vis-à-vis du VIH-1, en (i) identifiant les domaines de l’hôte qui sous-tendent ces différences, (ii) déterminant si, et comment, le VIH-1 a évolué en adaptation à SAMD9/9L, et (iii) identifiant les différences dans les fonctions intrinsèques de SAMD9/9L. Par ailleurs, nous caractériserons les « courses aux armements » moléculaires anciennes et modernes et déterminerons comment la composition génétique actuelle de SAMD9/9L chez les primates constituerait une barrière naturelle aux lentivirus, et comment cela résulte d’anciennes épidémies. Pour ce faire, nous combinerons des tests génomiques, phylogénétiques et fonctionnels afin de caractériser l’évolution fonctionnelle du locus au niveau inter- et intra-espèce, en nous concentrant sur les hominidés.

En parallèle et en combinant des techniques de biologie moléculaire, biochimie et biophysique, nous allons déterminer la fonction moléculaire exacte de SAMD9L en mesurant sa liaison avec l’ATP et autres nucléotides triphosphates. Nous déterminerons aussi sa capacité de liaison, ou processing, de substrats d’acides nucléiques (tRNA, rRNA, viral RNAs). Aujourd’hui, seule la structure d’une portion N-ter de SAMD9 (AlbA) a été résolue. Nous utiliserons ici différentes techniques de biologie structurale intégrative (cristallographie aux rayons X et Cryo-EM) pour résoudre la structure de SAMD9/9L et des domaines isolés, apportant une compréhension nécessaire de sa fonction et son organisation architecturale en tant que “hub” moléculaire.

Ces découvertes ouvriront des voies importantes pour la compréhension de la fonction et de l’évolution de ces protéines modulant la réplication du VIH, ainsi que leur importance contre les infections lentivirales et dans les maladies génétiques.

L’hépatite B chronique (HBC) est un problème majeur de santé publique affectant 300 millions d’individus de par le monde et est la cause majeure de l’insuffisance hépatique, de la cirrhose et du carcinome hépatocellulaire. En raison de la persistance de l’ADN circulaire clos de façon covalente (ADNccc) du virus de l’hépatite B (VHB), une guérison complète par les traitements actuels n’est pas possible. De nouvelles stratégies sont requises pour le traitement du VHB, incluant l’identification de biomarqueurs sériques représentatifs de l’activité de la molécule d’ADNccc intrahépatique, afin d’améliorer la prise en charge des patients et le développement de nouveaux traitements antiviraux. De nombreuses données convergent vers l’idée que les ARN circulant du VHB (cirB-ARN) pourraient servir de biomarqueurs sériques de l’infection par le VHB, de son traitement et de son pronostic. En revanche, la nature de ces ARNs et des particules les contenant in vivo et in vitro font actuellement l’objet de débat.

            Ce projet, destiné à financer la thèse de doctorat associée, ambitionne de profiler les protéines associées aux vésicules extracellulaires sécrétées dans des hépatocytes infectés ou non par le VHB, dans des échantillons de patients chroniquement infectés, et d’évaluer l’effet de traitements par analogues de nucléot(s)ides sur le protéome sécrété. Cela permettra la génération d’un jeu de donnée sans précédent qui orientera le choix de protéines cibles pour une analyse mécanistique en profondeur. Une meilleure connaissance des mécanismes contrôlant la sécrétion des ARNs d’HBV selon les phases de l’hépatite B chronique aidera à comprendre la valeur diagnostique du biomarqueur et participera au développement d’outils de diagnostic dédiés.

Contexte

L’histoplasmose, la talaromycose et la cryptococcose sont des infections fongiques invasives (IFI) graves chez les patients vivants avec le VIH à un stade avancé. Bien que ces agents pathogènes soient probablement endémiques au Cambodge, peu ou pas de données sont disponibles, en particulier pour l’histoplasmose et la talaromycose. La méconnaissance de ces infections et la disponibilité insuffisante de méthodes diagnostiques fiables conduisent à un retard de diagnostic et donc de traitement spécifique, responsable d’une mobi-mortalité excessive. Ces dernières années, les méthodes antigéniques et moléculaires sont apparues comme des outils prometteurs pour le diagnostic rapide des infections fongiques invasives. Notre objectif principal est d’évaluer, à l’aide de ces nouvelles méthodes, la prévalence de ces infections chez les patients atteints d’une maladie VIH avancée au Cambodge. Ce travail de recherche sera associé à un renforcement des capacités cambodgiennes en termes de transfert de compétence d’outils diagnostic simple des IFI et de formations clinique des acteurs de soins locaux sur les IFI.

Méthodes

C’est une étude rétrospective avec analyses sur une biobanque. Nous utiliserons les échantillons de l’étude STATIS, une étude sur la prise en charge diagnostique de la tuberculose menée chez 199 patients cambodgiens vivants avec le VIH avec des avancé (lymphocytes T CD4+ <100/mm3). Nous réaliserons d’abord des tests antigéniques spécifiques pour chaque pathogène. Comme la réactivité croisée de ces tests entre l’histoplasmose et la talaromycose est inconnue, nous confirmerons les résultats positifs par une PCR quantitative spécifique. Nous organiserons un atelier de formation au laboratoire pour initier l’équipe à l’utilisation du test et pour mettre en place un programme de formation, ainsi qu’un atelier de formation clinique pour les cliniciens en charge de patients à risque de mycoses invasives dans les hôpitaux de Phnom Penh.

Résultats attendus et perspectives

Ce projet fournira les premières données sur la prévalence de l’histoplasmose et de la talaromycose chez les patients vivants avec le VIH à un stade avancé au Cambodge. Cette étude permettra également de sensibiliser les acteurs locaux à ces diagnostics différentiels de la tuberculose ainsi qu’à l’existence de coinfections. La formation des équipes locales aux nouvelles méthodes diagnostiques permettra de poursuivre les recherches sur ce problème de santé publique, notamment par des études prospectives sur les infections fongiques invasives au Cambodge.

Les rétrovirus humains HTLV-1 et HIV-1 possèdent la particularité de se transmettre de façon très efficace par contacts entre les cellules infectées productrices de virus et les cellules cibles. Ce mécanisme reste un processus mal connu, alors qu’il est non négligeable dans le cycle des rétrovirus. En effet, il permet (i) d’éviter ou de limiter la neutralisation par le système immunitaire et (ii) de réduire la vitesse de diffusion du virus dans les milieux extracellulaires avant l’attachement aux cellules cibles et (iii) augmente la quantité de virus délivré dans les cellules cibles. De plus, ce processus de transmission virale échappe aux mécanismes de restriction cellulaires ainsi qu’à l’action des antiviraux. Il est donc crucial de mieux caractériser la transmission virale après contact cellulaire pour pouvoir mieux contrôler la dissémination virale.

Trois voies de transfert des particules virales ont été décrites pour les rétrovirus HIV-1 et HTLV-1 : (i) la synapse virologique, (ii) la formation de conduits intercellulaires et (iii) le transfert de particules virales stockées au niveau d’agrégats extracellulaires adhésifs à la surface des cellules infectées, ou biofilms viraux. Des études récentes montrent que le biofilm viral est polarisé, et que le maintien de cette polarité est déterminant pour l’infection des cellules cibles lors du contact cellule-cellule. Les protéines cellulaires responsables du maintien de cette polarisation et leur implication dans l’assemblage des virions et leur transfert aux cellules cibles ne sont pas totalement identifiées, ni pour les biofilm de HTLV-1 ni pour ceux de HIV-1 décrits plus récemment. Lors d’un précèdent projet financé par l’ANRS, nous avons identifié que la tétraspanine CD82 et la cavéoline sont responsables du maintien de la polarisation du biofilm de HTLV-1 et de sa capacité infectieuse. Pour HIV-1, seul le collagène a été identifié comme important pour le maintien de la polarisation. Nous souhaitons donc dans ce projet de recherche poursuivre la caractérisation des biofilms de HIV-1 et HTLV-1 afin d’identifier les constituants cellulaires responsables des plateformes polarisées d’assemblage des virions et déterminer comment ces plateformes macromoléculaires participent à la transmission virale. En réalisant ces études en parallèle sur des cellules infectées par HIV-1 et par HTLV-1, nous pourrons comparer la structure, la composition moléculaire, les propriétés physiques des biofilms rétroviraux et identifier les mécanismes moléculaires responsables de la transmission des biofilms HTLV-1 et HIV-1 à l’infection des lymphocytes T CD4 cibles.

Nous utiliserons pour cela des approches innovantes d’imagerie de pointe, (microscopie à fluorescence haute résolution, microscopie à force atomique, microscopie électronique à balayage) combinées à des techniques de virologie moléculaire (modification des protéines virales) et de biologie cellulaire (invalidation génétique des constituants des biofilms, analyse des complexes macromoléculaires, mesure de la transmission virale).

Nous anticipons que nos résultats permettront des avancées majeures dans la compréhension des mécanismes de transmission virale par contact cellulaires, tout comme l’a été la découverte pionnière de la synapse virologique formée par les cellules infectées par HTLV-1, mécanisme ensuite également démontré comme responsable de la transmission de HIV-1 par contact cellulaire. A plus long terme, nos résultats pourront ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques en ciblant par exemple les voies de biogénèse des biofilms, leur mobilité à la surface des cellules infectées ou les composants (protéiques ou lipidiques) responsables de leur transmission d’une cellule infectée à sa cible.

En 2021, la tuberculose demeure la principale cause de décès, d’origine bactérienne, à l’échelle mondiale. La difficulté à éradiquer la maladie est liée à trois facteurs principaux : la faible efficacité du vaccin BCG, la co-infection avec le virus de l’immunodéficience humaine et l’apparition croissante de souches multi-résistantes aux antibiotiques. En outre, la pandémie de Covid-19 a fortement aggravé la situation en déstabilisant les efforts de lutte contre la tuberculose. Par conséquent, le développement de thérapies innovantes, notamment celles dirigées par l’hôte, reste une priorité majeure. Avant tout, de telles avancées exigent une meilleure compréhension des interactions moléculaires entre l’agent étiologique, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), et son hôte.

Mtb est un pathogène intracellulaire qui se multiplie dans l’environnement hostile des macrophages. Au départ, présent dans une vacuole appelée phagosome, Mtb peut ensuite accéder au cytosol du macrophage après avoir endommagé la membrane phagosomale. L’entrée de Mtb, ou ses facteurs, dans le cytosol entraîne la modulation de plusieurs réponses immunitaires innées, notamment la production de cytokines, l’autophagie et la mort cellulaire. A ce jour, les facteurs connus sont essentiellement des protéines et des acides nucléiques qui interagissent avec des protéines cytosoliques afin de moduler les fonctions du macrophage. Etonnamment, le rôle des lipides de Mtb dans ce processus a été largement inexploré. Pourtant, Mtb produit de nombreux lipides, de structure diverses, ayant d’importantes propriétés immunomodulatrices. Pour ce faire, ils interagissent avec des protéines présentes à la surface ou dans la voie endocytique des cellules de l’hôte. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que les lipides de Mtb pourraient aussi se lier à des protéines cytosoliques afin de déclencher ou de détourner les réponses du macrophage.

L’objectif de ce projet « Contrat d’Initiation » est d’identifier les protéines cytosoliques des macrophages qui interagissent avec deux glycolipides majeurs, présents à la surface de Mtb, le tréhalose dimycolate (TDM) et le lipoarabinomannane mannosylé (ManLAM). Les objectifs spécifiques sont les suivants :

1. Identifier les protéines cytosoliques qui se lient, in vitro, au TDM et au ManLAM purifiés (Mois 1-2). Dans un premier temps, nous réaliserons des expériences de « pull-down » avec des billes recouvertes de ces lipides et un extrait cytosolique de macrophage. Les protéines associées aux billes seront identifiées grâce à une analyse protéomique. Un maximum de six protéines avec un domaine liant les lipides ou les sucres seront sélectionnées pour les objectifs 2 et 3.
2. Valider la liaison directe avec des protéines recombinantes (Mois 2-5). Dans un second temps, nous mesurerons la liaison de la protéine recombinante, étiquetée, avec le lipide purifié en utilisant un essai de type ELISA, et ensuite la liaison avec Mtb par Westernblot.
3. Evaluer le recrutement des protéines candidates dans les macrophages (Mois 5-12). Enfin, nous quantifierons la colocalisation de la protéine d’intérêt avec les phagosomes endommagés contenant soit une bille recouverte du lipide de Mtb, soit la bactérie entière, dans les macrophages, par microscopie de fluorescence confocale.

Dans son ensemble, le projet CyTuLip permettra de faire la preuve de concept que les lipides immunomodulateurs de Mtb peuvent aussi interagir avec des protéines cytosoliques, in vitro et dans les macrophages. Ces résultats seront le point de départ d’un projet de recherche beaucoup plus vaste dédié à l’étude de ces nouvelles interactions, à la fois leurs bases moléculaires et leurs rôles dans l’infection à Mtb. In fine, ces travaux pourraient aboutir à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour la lutte contre la tuberculose.

Le but du projet REINVENT-ART est d’étudier l’impact de la thérapie antirétrovirale combinée (ARV) et de l’interruption de thérapie sur le compartiment immunitaire et microbien intestinal lors d’une infection par le SIV. Cette proposition est complémentaire du projet REINVENT (cx3cR1+ cElls IN hiV-1 infEction, immuNity and microbioTa), financé par l’ANRS, qui vise à éclairer le rôle joué par les cellules mononucléaires intestinales CX3CR1 + pendant l’infection par le VIH-1 / SIV.

Les phagocytes mononucléaires intestinaux (MP) exprimant le récepteur de la fractalkine CX3CR1 sont des sentinelles cruciales pour le maintien de l’homéostasie intestinale et sont connus pour être importants pour le maintien de la barrière épithéliale. Nous avons montré que ces cellules sont affectées très tôt pendant l’infection par le SIV et l’hypothèse est que cela contribue à la perte de la barrière intestinale, favorisant la translocation microbienne, l’établissement de la dysbiose, l’activation immunitaire et l’inflammation qui caractérisent l’infection par le VIH-1. Si l’ARV contribue au maintien de la population de MP CX3CR1 +, limitant ainsi ces effets, n’est pas connu et sera l’objectif de cette étude. Une question clé sans réponse, par conséquent, est de savoir si l’ARV initié tôt (dans un délai d’un mois après l’infection) peut réduire plus efficacement les dysfonctionnements liés aux cellules CX3CR1 + que l’ARV initié en phase chronique. Une question connexe est de savoir si l’initiation précoce de l’ARV limite durablement l’établissement de la dysbiose.

En utilisant le modèle de l’infection par le SIV chez le macaque cynomolgus et des approches in vivo, le projet se concentrera sur l’objectif de définir les premières étapes qui conduisent à l’inflammation intestinale, l’activation immunitaire systémique et la dysbiose au cours d’une infection SIV non traitée et traitée. L’ analyse du compartiment immunitaire et microbien intestinal chez: 1) les animaux non traités, 2) les animaux qui ont commencé l’ARV précocement (4 semaines après l’infection) ou pendant la phase chronique (24 semaines après l’infection), et 3) les animaux avec ou sans interruption du traitement antirétroviral (ATI), permettra de définir si l’ARV pourrait avoir un effet protecteur par la préservation des principales cellules immunitaires intestinales, telles que les MP CX3CR1 +, connues pour être les sentinelles de l’intégrité intestinale.

La compréhension de l’activation immunitaire dans le contexte de l’ARV est d’une importance fondamentale car l’activation immunitaire résiduelle en présence d’un traitement suppressif conduit à une morbidité et une mortalité immuno-sénescence et non liées au SIDA.