Projets et candidats lauréats

Du fait de l’accès aux nouveaux traitements efficaces contre le virus de l’hépatite C (VHC), quel que soit le niveau de fibrose hépatique, l’éradication de l’hépatite C parait imminente. Cependant, les réinfections par le VHC après traitement dans les populations à risque constituent un frein majeur à cette éradication, notamment chez les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH). En France, la grande majorité des nouvelles infections par le VHC est dépistée parmi les HSH.

Malgré le recours élevé aux traitements anti-VHC dans cette population, la modélisation a montré que l’éradication ne pourra se faire sans une diminution importante des comportements à risque. Ceci souligne la réelle nécessité de mettre en place des mesures efficaces pour réduire les prises de risque et prévenir les réinfections chez les HSH guéris après traitement. Pour ce faire, nous proposons de réaliser un essai randomisé en trois bras, évaluant deux stratégies innovantes, ainsi que la combinaison des deux, chez les HSH ayant guéri de leur hépatite C.

La première stratégie (intervention I) est de sensibiliser les patients par le biais d’une application informative et interactive en ligne ciblant les comportements à risque des patients. Cette application est développée grâce à un projet collaboratif. La seconde stratégie (intervention II) a pour objectif d’augmenter la fréquence de dépistage de l’ARN du VHC en proposant aux patients un auto-prélèvement à domicile (piqure au bout du doigt et recueil de gouttes de sang sur papier buvard puis envoi pour analyse à l’hôpital). La troisième stratégie (intervention III) est une combinaison des deux premières.

Cet essai, mené en partenariat avec le Service de Santé Publique d’Amsterdam (Pays-Bas) sera réalisé dans plusieurs centres en France.

Ce projet novateur contribuera à évaluer la faisabilité de ces stratégies et de déterminer si leur utilisation permet de mieux cibler les programmes de prévention et, ainsi, de diminuer les réinfections par le VHC.

La compréhension des mécanismes responsables de la latence du VIH-1 représente actuellement un enjeu majeur. Parmi ces mécanismes, la latence provirale ciblant la transcription contrôlée par le LTR5′ est considérée comme un état viral silencieux. Hors, il est maintenant démontré qu’en plus d’une transcription sens, le VIH-1 possède une transcription antisens. Différentes populations d’ARN antisens (non-épissés et épissés) ont été décrites in vitro, en particulier dans des lymphocytes T infectés de façon latente. Ceci modifie de façon profonde la vision de la latence provirale. En effet, le virus n’est pas « dormant » puisque des produits antisens sont détectés. En outre, des données de différentes équipes montrent que les transcrits antisens pourraient être directement acteurs de la latence en influençant l’activité du LTR5′ ou sa réactivation. Nous faisons l’hypothèse que les transcrits antisens pourraient jouer un rôle important dans la latence in vivo, en particulier chez les sujets infectés contrôlant la réplication virale.

Notablement, l’expression des transcrits antisens a été montrée chez des patients sous thérapie antivirale, mais pour le moment uniquement chez 5 sujets. Il parait donc nécessaire de lancer une étude à large échelle pour confirmer  l’expression des transcrits antisens in vivo, en lien avec les différentes situations cliniques. Dans ce cadre, notre objectif global est de mettre en place les outils et méthodes nécessaires à l’étude de la transcription antisens du VIH-1 dans des lymphocytes T de patients. Nous nous appuierons sur nos travaux portant sur le HTLV-1, qui nous ont déjà conduits à développer un protocole de RTqPCR spécifique des ARN antisens. Nous allons travailler sur deux objectifs spécifiques:

1) Mise au point d’un protocole de RTqPCR applicable aux échantillons cliniques

Pour les différentes mises au point, nous allons travailler sur des ARN extraits de lymphocytes T CD4+ Jurkat non infectés ou infectés avec la souche pNL4.3.

Pour les transcrits épissés, nous utiliserons des amorces spécifiques de la jonction d’épissage, assurant une détection spécifique. Pour les transcrits non épissés, nous utiliserons le protocole « RT tag » mis en place pour le HTLV-1, basé sur une amorce de transcription inverse composée d’une séquence neutre (tag) fusionnée à une séquence complémentaire du brin antisens. La PCR est ensuite réalisée en utilisant la séquence tag et une séquence virale comme amorces.

L’application aux patients nécessite de prendre en compte la diversité virale. En nous basant sur les séquences du groupe M disponibles (HIV Sequence Compendium), nous rechercherons dans chaque région d’amplification la zone la plus conservée et introduirons des bases dégénérées pour permette la détection d’un maximum de variants. Nous testerons ensuite les meilleures conditions en termes de concentration de primers, température et durée d’amplification et de méthode de PCR et de normalisation (gènes de ménage, transcrits sens, charge provirale).

2) Caractérisation de l’expression des transcrits antisens dans des lymphocytes T CD4+ 

Nous quantifierons le niveau d’expression des lymphocytes T dans des Jurkat J1.1 (provirus complet) avant (latence) ou après (productive) réactivation par le TNF.

Nous étudierons également l’expression des différents transcrits dans des cellules Jurkat infectées par la souche pNL4.3 après blocage ou induction de la transcription sens. Nous répéterons ces expériences dans des lymphocytes T CD4+ primaires infectés in vitro soit par la souche pNL4.3 soit par un isolat primaire (91US054 clade B). Nous nous intéresserons aussi à l’étape de réactivation de provirus latents en nous basant sur l’article de Martins et al (PMID:30918072) ayant analysé la réactivation virale dans des lymphocytes T CD4+ primaires mémoires générés et infectés in vitro.

Ce premier travail nous fournira les conditions pour comparer l’expression des transcrits antisens dans différentes cohortes de patients infectés par le VIH-1. Ceci se fera en collaboration avec le groupe de Véronique Avettand-Fènoël, spécialiste du suivi des patients, qui a rejoint notre équipe en 2019.

Les cellules Natural Killer (NK) sont des lymphocytes de l’immunité innée et constituent la première ligne de défense contre les cellules infectées ou tumorales. Cependant, en contexte de stimulation chronique, un état de tolérance ou d’épuisement des cellules NK a été observé. Les bases moléculaires conduisant à l’épuisement demeurent mal caractérisées et la possibilité de restaurer la fonctionnalité des cellules NK n’est pas décrite. A partir des publications précédentes de l’équipe, nous avons supposé qu’une stimulation chronique des NK induit une altération de l’activité de la voie mTOR conduisant à l’épuisement. Grâce à un précédent support de l’ANRS (Appel 2016-1), nous avons pu étudier la dysfonction des cellules NK en contexte d’infection chronique par HBV. Pour cela, nous avons établi différents panels de cytométrie en flux permettant l’analyse du phénotype, de la fonctionnalité, du métabolisme et des capacités de signalisation de cellules NK chez des patients chroniquement infectés. En effet, nous avons recruté une cohorte de patients  classés rétrospectivement comme porteurs inactifs.  Des changements phénotypiques ont pu être observés tels que des altérations de l’expression des récepteurs CD160, NKp30, CD16 et Tim-3, l’expansion de la population de cellules NK adaptatives (FCεRg- NKG2C+ or CD57high) mais également l’augmentation de l’expression de CD107a au niveau basal (marqueur de dégranulation), de NKG2D et 41BB. Des changements au niveau fonctionnels comme la diminution de la production d’IFNγ et de MIP1β mais également l’augmentation des niveaux deTGF-β dans le sérum des patients, ont été mis en évidence. De plus, nous avons observé une diminution de la phosphorylation des protéines S6 et Akt (protéines en aval de l’activation de mTOR) chez les patients (cf rapport Appel 2016-1). La diminution de la fonction des cellules NK ainsi que l’augmentation de la dégranulation basale chez les patients suggère un état d’épuisement des cellules NK. Enfin, nos données provenant de modèles in vitro où des PBMCs sont exposées au virus, suggèrent que le composé viral HBsAg conduit à la dérégulation de la voie mTOR.

Notre demande de financement d’une année supplémentaire est nécessaire à l’analyse d’une seconde cohorte de patients en cytométrie de flux multiparamétrique. L’inclusion des patients est actuellement en cours et les patients recrutés représentent les 5 phases de l’infection (immunotolérance, immune active, immune inactive, réactivation et patients sous traitement). Notre but est d’examiner le phénotype, la fonction et les voies de signalisation potentiellement altérées afin de déterminer la cinétique de l’épuisement et de la dérégulation de mTOR au cours des différentes phases de l’infection. En parallèle, en utilisant nos modèles in vitro actuellement en cours d’optimisation, nous souhaitons identifier les mécanismes utilisés par le virus et plus particulièrement HBsAg pour induire la perte de fonction de mTOR et ainsi l’épuisement des cellules NK.

Les enquêtes de séroprévalence SARS-CoV-2 en population répétées, permettant de décrire l’épidémie, sa dynamique et l’acquisition d’une immunité de groupe apportent une information stratégique pour la riposte à l’épidémie. Il n’existe pas encore de telles études en Afrique sub-Saharienne.

Objectifs

Objectif principal

Décrire la dynamique de l’épidémie à SARS-CoV-2 dans la ville de Conakry, représentée par l’évolution au cours du temps de la séroprévalence stratifiée sur l’âge (<15 ans, 15-39 ans, 40 ans+).

 Objectifs secondaires

• Estimer la proportion de cas asymptomatiques ou pauci-symptomatiques parmi les participants avec une sérologie positive à l’infection au virus SARS-CoV-2
• Estimer la séroprévalence globale et par classe d’âge dans chacune des enquêtes
• Estimer dans chaque enquête le nombre de cas confirmés ou probables d’infection à SARS-CoV-2 parmi les participants présentant une sérologie positive.
• Décrire les caractéristiques démographiques, cliniques et immunologiques de la population séropositive et séronégative au virus SARS-CoV-2
• Analyser de manière rétrospective les conditions sociologiques de la contamination des individus confirmés sérologiquement.

Lieu et Population d’étude : Gouvernorat de Conakry. Résidents des ménages sélectionnés.

Méthodologie

Trois enquêtes répétées en population espacées de 6 semaines.  Pour chaque enquête, le plan d’échantillonnage utilisera un sondage aléatoire à deux niveaux afin d’obtenir un échantillon représentatif de la population de Conakry. Chaque enquête est indépendante l’une de l’autre.

Calcul de la taille d’échantillon : 1400 individus par enquête.

Le calcul de la taille d’échantillon est basé sur la capacité à mettre en évidence une différence de séroprévalence de 10% entre la première et la deuxième enquête chez les participants âgés de 40 ans et plus, représentant la plus petite classe d’âge (17,5% des résidents de Conakry). 

Etant donné un coefficient de corrélation intra-foyer de 0,10 un taux de participation de 90%, une moyenne d’un individu âgé de 40 ans+ par foyer (en moyenne 6 résidents par ménage), un risque de première espèce α=0,05 et une puissance de 0,8 (β=0,2), il faudra inclure dans chaque enquête 380 résidents âgés de 40 ans+, soit 380 ménages, arrondi à 400 ménages, soit 40 grappes de 10 foyers pour chaque enquête.

Pour équilibrer les groupes, les individus de moins de 40 ans ne seront invités à participer à l’étude que dans 50% des ménages. Au total, 1400 individus seront invités à participer à chaque enquête (400 de 40 ans+ et 5 résidents de moins de 40 ans dans 50% des 400 des ménages sélectionnés).

 Clinique. La proportion de cas symptomatiques et asymptomatiques parmi les participants séropositifs pour le SARS-Cov-2 sera estimée par interrogatoire lors de l’enquête à domicile.

 Sérologie.  La collecte d’un échantillon de sang total capillaire sur papier filtre se fera dans les ménages et les analyses seront réalisées dans le laboratoire du CERFIG avec la technique multiplex Luminex.

Composante qualitative. Une enquête qualitative rétrospective sera conduite auprès 20 participants séropositifs représentatifs de la diversité démographique et socio-économique de Conakry.

Durée de l’étude.  Un an. Les trois enquêtes seront espacées de 6 semaines. Chaque enquête représentera une collecte de données de 10 jours.

Considérations éthiques

Cette étude sera conduite dans le respect de la réglementation guinéenne en vigueur et de la charte éthique de l’ANRS pour les pays en développement.

Pour tout membre du ménage qui est éligible et intéressé à participer, l’enquêteur obtiendra le consentement éclairé de l’individu (tuteur légal en cas de mineur et permission des mineurs de plus de 10 ans). Les noms des participants ne seront pas saisis dans la base de données.

Le protocole, les formulaires de consentement éclairé/permission (pour les enfants), les questionnaires et toute modification ultérieure, seront examinés en Guinée par le Comité National d’Ethique pour la Recherche en Santé (CNERS) en ce qui concerne la conformité éthique aux réglementations applicables à la recherche et aux sujets humains.

Le virus de l’hépatite E (HEV) est la cause la plus fréquente d’hépatites aiguës dans le monde. Les souches infectant l’homme appartiennent à l’espèce Orthohepevirus A. Les génotypes 3 et 4 sont notamment responsables d’hépatites chroniques chez la personne immunodéprimée et le génotype 1 d’hépatite fulminante chez la femme enceinte. Le HEV est un virus à ARN simple brin de polarité positive, retrouvé sous forme d’une particule nue dans les selles des patients et le milieu extérieur mais qui quitte la cellule infectée et circule dans le sang sous la forme d’une particule associée aux lipides. Les mécanismes qui conditionnent le bourgeonnement de cette particule, dite quasi-enveloppée, sont encore mal connus. Le bourgeonnement des particules HEV emprunte des éléments de la voie des exosomes ; nos résultats préliminaires indiquent aussi un rôle de l’autophagie dans le cycle du HEV. Nous avons développé un système de culture du HEV sur hépatocytes polarisés en culture qui reproduit les principales caractéristiques physiologiques de l’hépatocyte et permet d’analyser les sécrétions apicale (biliaire) et basolatérale (vasculaire). Nous avons montré que le HEV est sécrété sous une forme quasi-enveloppée aux deux pôles de l’hépatocyte mais que les particules infectieuses sont préférentiellement sécrétées du côté biliaire. Exocytose, autophagie et polarisation épithéliale sont liées par certaines protéines communes. L’objectif de ce projet est d’explorer le rôle de l’autophagie dans le bourgeonnement du HEV en tenant compte de la polarisation de l’hépatocyte.

L’expression de protéines clés de la voie d’autophagie sera éteinte par la transfection de shRNA dans les cellules polarisées et leur effet sera évalué par la quantification de l’ARN HEV intra- et extracellulaire et de l’infectiosité des particules sécrétées. Des analyses de colocalisation des protéines virales ORF2 et ORF3 avec des marqueurs des vésicules impliquées dans l’autophagie et l’exocytose seront réalisées à partir d’images obtenues en microscopie confocale. Pour une analyse fine de ces colocalisations, nous utiliserons ensuite la microscopie de super-résolution.

Nous avons identifié dans la séquence de la protéine de capside ORF2 un domaine homologue à un domaine LIR (LC3 interacting region). Nous étudierons l’interaction de la protéine de capside ORF2 et de la protéine de l’autophagie LC3B par communoprécipitations et mutagenèse dirigée de la séquence LIR.

Les phosphoinositides (PI) font partie des molécules ségrégées lors du processus de polarisation avec un enrichissement en phosphatidylinositol(4, 5) biphosphate [PtdIns(4,5) P2] au pôle apical et en PtdIns (3, 4, 5) P3 au pôle basolatéral. Nous souhaitons déterminer si les sites membranaires enrichis en PtdIns (4,5)P2 au pôle apical sont ceux où s’accumulent les protéines ORF2 et ORF3. Nous étudierons en outre la distribution de la PI kinase de classe I et de PTEN (PI3P phosphatase), les enzymes qui assurent la transition du PtdIns (4,5)P2 au PtdIns (3, 4, 5)P3 et inversement, ainsi que celle du cholestérol.

Pour compléter cette étude, et comprendre les différences de densité et d’infectiosité que nous avons observées entre le pôle apical et le pôle basolatéral, nous déterminerons la composition des particules virales sécrétées à chaque pôle par des expériences de protéomique et de lipidomique.

Ce travail permettra de mieux comprendre les voies de sécrétion biliaire et vasculaire que détourne le HEV pour se propager. La détermination d’acteurs clés du cycle viral pourrait ouvrir la voie à la mise en évidence de nouvelles molécules antivirales, agissant sélectivement sur les voies de sécrétion polarisées pour limiter l’infection de l’hôte et la propagation du HEV.