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Détournement des protéines à PDZ de l’hôte pendant l’infection par le virus de l’hépatite B

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) constitue un problème majeur de santé publique mondial. Il y aurait actuellement plus de 350 millions de porteurs chroniques du VHB et plus de 1 million de morts par an. Il existe pourtant une prophylaxie efficace par la vaccination depuis plus de 20 ans. Malgré́ cela, l’hépatite B chronique est toujours une maladie incurable. L’infection est caractérisée par une hépatite aiguë, conduisant fréquemment à une chronicité sans symptômes, entraînant une possible progression lente vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire (HCC) dont le VHB est la cause principale (> 70 %).

Le matériel génétique sous forme d’ADN du VHB est protégé par une capside protéique composée de la protéine de core (HBc). HBc, en dehors de son rôle dans la formation des capsides, est impliquée dans différentes étapes de la réplication virale comme la transcription inverse de l’ARN prégénomique en ADN ou le transport dans le noyau de l’ADN viral au moment de l’infection. HBc est également recrutée sur l’ADN viral nucléaire (ADNccc) et modifie sa structure. Il est suggéré́ qu’HBc régule également la transcription du VHB ainsi que la transcription de gènes cellulaires. Ainsi, HBc interagit potentiellement avec de multiples protéines de l’hôte lors du cycle viral.

HBc contient un motif de reconnaissance aux domaines PDZ (appelé PBM pour PDZ-binding motif) exposé à l’extrémité C-terminale de sa séquence. Ces motifs PBM interagissent avec une grande famille de domaines d’interaction protéine-protéine appelés PDZ (PSD-95/Dlg/ZO-1) qui interviennent dans de nombreuses voies de signalisation humaine. De nombreux virus utilisent des PBMs codés dans leurs protéines virales pour capturer les protéines contenant des PDZ et détourner leurs fonctions. Des PBMs viraux peuvent être des facteurs de virulence tel que ceux de la protéine d’enveloppe du SARS-CoV ou du virus de la Rage, mais interviennent aussi dans l’oncogénicité des papillomavirus à haut-risque. Les perturbations dues aux interactions entre les PBMs viraux et les protéines cellulaires contenant des domaines PDZ favorisent le cycle de vie du virus chez l’hôte et la dissémination vers de nouveaux hôtes. Ainsi, le ciblage de l’interface PBM viral-PDZ de l’hôte pourrait conduire à de nouvelles thérapies antivirales.

Les cibles d’HBc contenant des domaines PDZ dans la cellule infectée sont peu connues. Le PBM d’HBc du VHB a été rapporté comme interagissant avec seulement deux protéines à PDZ humaines : la phosphatase PTPN3 et la protéine GIPC1. Nous avons récemment identifié de nouveaux partenaires cellulaires potentiels de HBc par le biais d’interactions PDZ-PBM en criblant le PBM d’HBc contre notre bibliothèque complète de domaines PDZ humains.

Le projet est divisé en trois parties :

– La sélection de protéines à domaine PDZ pertinentes pour la réplication virale parmi les protéines interagissant avec le domaine PBM d’HBc et identifiées lors du criblage de la banque de PDZs humains. Celles-ci seront sélectionnées en mesurant l’effet de leur extinction par siRNA sur la réplication virale dans des cellules infectées.

– L’étude plus approfondie des protéines à PDZ sélectionnées en validant leur rôle dans différents modèles cellulaires et en identifiant l’étape du cycle viral affecté.

– La caractérisation des propriétés fonctionnelles et structurales d’HBc en interaction avec les protéines à PDZ, sélectionnées pour leur impact sur le cycle viral, en utilisant une approche couplée de biologie structurale intégrative et de biophysique.

L’identification de protéines cellulaires impliquées dans les activités d’HBc et la caractérisation structurale de leurs interactions ouvriront de nouvelles pistes de recherches sur la physiopathologie du VHB et pourraient conduire à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement de l’hépatite B chronique.

Le laboratoire a précédemment montré que le degré d’apoptose détectable dans les organes lymphoïdes au cours de la phase de primo-infection chez le macaque rhésus infecté par le virus SIVmac251 est prédictif de l’évolution ultérieure vers un Sida. Nos récents travaux montrent que l’injection au cours de la phase de primo-infection d’un inhibiteur des caspases, diminue la mort des lymphocyte T CD4, réduit l’inflammation ainsi que la charge virale plasmatique, et impacte sur l’évolution vers un Sida. Parallèlement, nous avons montré que l’infection par SIV conduit à une déplétion précoce des cellules T folliculaires auxiliaires (Tfh) dans la rate comme dans les ganglions mésentériques.

Nous souhaitons dans ce projet déterminer dans quelle mesure cet inhibiteur de caspases permet d’améliorer des stratégies antivirales actuelles, et de préserver les cellules Tfh et ainsi améliorer la réponse humorale, capable de réduire les réservoirs viraux. Ainsi, nous nous proposons d’analyser (i) la dynamique des cellules Tfh et le profil d’expression génique, (ii) la dynamique des cellules B, la production d’anticorps spécifiques, et la redistribution des cellules en relation avec le remodelage du follicule B dans les tissus lymphoïdes, ainsi que (iii) la taille des réservoirs viraux, la diversité génétique du virus et le rebond viral après interruption  de la ART.

Cette étude jettera les bases d’études visant à améliorer les thérapies chez les personnes vivant avec le VIH.

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) est l’un des principaux facteurs de risque d’hépatite chronique, de fibrose hépatique, de cirrhose et de cancer hépatocellulaire (CHC). L’inflammation joue un rôle important dans la clairance virale. Mais une inflammation excessive cause des lésions hépatiques et peut accélérer la progression de la fibrose et développement du CHC. L’HBC provoque le dysfonctionnement des réponses immunitaires innées et adaptatives impliquant les monocytes/macrophages, les cellules dendritiques (DC), les cellules tueuses naturelles (NK), les cellules B et les cellules T. Cependant, les mécanismes qui lient les altérations immunitaires induites par le VHB et les atteintes hépatiques liées au VHB restent mal compris. Dans le projet proposé, nous visons à étudier le microenvironnement immunitaire dans différents groupes bien définis de patients atteints d’HBC et appartenant à différents stades de fibrose en comparaison à des échantillons de foies provenant d’individus sains. Nous utiliserons une technique de pointe, l’imagerie multiplexée CODEX, pour analyser la distribution des sous-populations immunitaires in situ, leurs interactions dans le tissue, ainsi que leurs réponses antivirales associées. Enfin, dans une approche mécanistique, nous étudierons la réponse fonctionnelle des cellules T CD8+ spécifiques de l’antigène afin d’évaluer leurs fonctions cytotoxiques et leur capacité à produire des cytokines pro- et anti-fibrotiques. L’identification des mécanismes de réponse immunitaire pendant l’HBC et pendant la progression de la fibrose hépatique permettront de mieux comprendre le rôle respectif de chaque sous-population immunitaire et aidera au développement de marqueurs immunitaires des lésions hépatiques.

Le lenacapavir (LEN) est la première molécule antirétrovirale commercialisée issue de la famille des inhibiteurs de capside (p24). Ces effets sur la prévention de l’infection de nouvelles cellules – effet pré-intégration – ont été bien caractérisés dans les études pré-cliniques. En revanche, une de ces études à montrer un effet possible du LEN sur la production de p24 – effet post-intégration. Le mécanisme derrière cette diminution de production de la capside n’a pas été élucidé, et serait une première pour une molécule antirétrovirale : les autres molécules déjà utilisées en cliniques n’ayant que des effets en pré-intégration.

Dans des expériences préliminaires in vitro nous avons montré une rapide diminution de l’expression intracellulaire de p24 par les cellules infectées en présence de LEN. Cette diminution résulte d’un mécanisme agissant en post-transcription et en pré-maturation. Une diminution de l’expression de p24, mais pas de l’enveloppe, est également retrouvée ex vivo, suggérant une action spécifique sur le précurseur gag. De plus, cette diminution d’expression intracellulaire de p24 était associée à une diminution de la production de particules virales. Au total, une diminution probable de l’expression de gag a été objectivée en présence de LEN, néanmoins, le mécanisme exact et les conséquences en aval pour les cellules infectées doivent encore être analysées.

En effet, ceci peut avoir divers impacts à la fois diagnostics et cliniques. Une diminution de l’expression de p24 pourrait diminuer la réactivité du test de dépistage par exemple lors d’une primo-infection décapitée sous Prophylaxie pré-exposition (PrEP) par LEN. De plus une diminution d’expression de p24 chez une personne infectée et traitée par LEN pourrait engendrer une diminution de la présentation des peptides gag à la surface des cellules infectées et donc diminuer l’inflammation chronique.

Objectif : Le but est de déterminer les effets du LEN sur la production de la capside p24 par les cellules infectées par le VIH in vitro et ex vivo.

Hypothèse : Le LEN engendre une dégradation intracellulaire de p24 dans les cellules infectées qui expriment et présentent alors spécifiquement moins la protéine et peptides p24.

Méthodologie : D’abord nous allons caractériser et valider les mécanismes de diminution de l’expression de p24 induite par le LEN in vitro. Parmi, les expériences réalisées nous allons analyser l’infectiosité des particules virales produites en présence de LEN, tester l’impact des mutations de résistance au LEN connues sur la diminution de l’expression de p24 intracellulaire et explorer les différents mécanismes cellulaires possibles de dégradation de p24 induite par le LEN. Ensuite nous allons observer si ces résultats sont similaires chez des personnes vivant le VIH traitées ou non ex vivo. Enfin, nous allons analyser indirectement le degré de présentation des peptides p24 en présence de LEN par une expérience de killing.

Éthique : Ce projet requiert le recueil de PBMC de personnes vivant avec le VIH (étude APRIL, autorisation CPP Est I 2022-A02567-36 le 15/1/2023).

Résultats attendus : L’objectif global de ce projet est d’améliorer notre connaissance sur le comportement des cellules infectées par le VIH en présence de LEN. En effet, caractériser l’effet du LEN sur la production de p24 est nécessaire pour en mesurer les impacts cliniques et diagnostics. Au final, ce contrat d’initiation ouvre la porte à d’autres études fondamentales et cliniques sur l’utilisation du LEN. Par exemple, une diminution de l’expression de p24 par les cellules infectées en présence de LEN pourrait induire une diminution de l’inflammation résiduelle.

Contexte :

La protéine régulatrice Rev du VIH-1, est une protéine nucléocytoplasmique de liaison à l’ARN, essentielle à la réplication virale. Rev est responsable de l’export nucléaire des ARN viraux non ou partiellement épissés, qui codent pour les protéines structurelles et enzymatiques virales et constituent l’ARN génomique incorporé dans les nouvelles particules virales. Rev est importée dans le noyau par le facteur de transport nucléaire de la cellule hôte, Importin β (Impβ). L’interaction entre Rev et Impβ est directe, et son inhibition bloque l’importation nucléaire de Rev et la réplication virale. Malgré le rôle essentiel du complexe Impβ/Rev dans le cycle d’infection virale, la base moléculaire de cette interaction reste mal comprise.

Objectif :

L’objectif à long terme de ce projet est de comprendre, à l’échelle atomique, comment Rev est importée dans le noyau de la cellule hôte. Pour atteindre cet objectif, nous cherchons à obtenir une structure 3D à haute résolution du complexe Impβ/Rev par cryo-microscopie électronique (cryo-ME). Nos efforts pour obtenir cette structure, en utilisant des méthodes conventionnelles, se sont jusqu’à présent avérés infructueux en raison de la petite taille et de la pseudo-symétrie du complexe Impβ/Rev. Pour surmonter ces obstacles, nous proposons une approche innovante, basée sur l’expérience que nous avons développée au sein du laboratoire, qui consiste à fusionner génétiquement Impβ à une protéine modèle dimérique. L’objectif spécifique du contrat d’initiation est de démontrer la faisabilité de cette approche, en déterminant une structure cryo-ME initiale du complexe Impβ/Rev à une résolution subnanométrique (idéalement inférieure à 5 Å).

Approche méthodologique :

Les données préliminaires révèlent que la fusion de Impβ au domaine de dimérisation d’une petite protéine bactérienne, EsxA de S. aureus, permet la production d’un homodimère soluble de 219 kDa, (EsxA-Impβ)2, qui forme des particules de taille et de forme attendues en microscopie électronique (ME) à coloration négative. Nos résultats montrent que cette construction initiale présente un degré de flexibilité au niveau de la liaison qui relie les deux protéines, et nécessite d’être optimisée afin d’obtenir un ensemble de particules plus homogène pour l’analyse par cryo-ME. L’optimisation sera réalisée en criblant un ensemble de mutants de délétion dans lesquels les résidus de liaison flexibles seront supprimés un par un. Chaque construction sera systématiquement exprimée et purifiée pour être caractérisée biophysiquement et visualisée par ME à coloration négative. Les constructions qui permettront d’avoir un ensemble de particules uniformes  seront ensuite analysées par cryo-ME à l’aide de notre microscope Glacios interne à l’institut, et les structures 3D correspondantes seront déterminées par analyse de particules uniques.

Résultats attendus :

L’approche développée devrait permettre d’obtenir une reconstruction cryo-ME du complexe Impβ/Rev à une résolution subnanométrique. Du fait que les hélices α sont visibles à cette résolution, et que Impβ et Rev sont des protéines hélicoïdales, ces premiers résultats nous permettront de positionner sans ambiguïté les structures atomiques connues de Impβ et Rev dans la carte cryo-ME et d’obtenir un premier aperçu de la façon dont Impβ reconnaît Rev. Il est important de souligner que ces résultats nous permettront de demander l’accès à un microscope cryo-électronique plus puissant (Titan Krios ou équivalent), qui nous permettra de déterminer une structure à haute résolution (idéalement mieux que 3 Å) qui révélera le détail des interactions impliquées dans la reconnaissance de Rev par Impβ. À plus long terme (au-delà de la portée de la présente demande de financement), nous exploiterons ces résultats pour identifier et générer des mutants qui compromettent l’interaction de Impβ et Rev. Ces mutants seront ensuite testés in vitro par des essais d’interaction et in vivo par des essais d’importation nucléaire de Rev dans des cellules, afin de confirmer l’implication des interactions moléculaires, structuralement identifiées, dans l’import nucléaire de Rev.