Winning projects and candidates

La tuberculose (TB) causée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est un enjeu mondial de santé publique, dont l’importance sera accentuée par la crise sanitaire de la COVID-19. Des stratégies innovantes sont nécessaires pour améliorer l’efficacité des traitements antituberculeux actuels. Le décryptage de la réponse immunitaire anti-Mtb pourrait guider des approches dirigées vers l’hôte (HDT), afin de renforcer les traitements antibiotiques dont nous disposons. Les lymphocytes T spécifiques de Mtb sont essentiels pour la guérison des patients tuberculeux. Dans ce projet nous proposons une approche translationnelle pour caractériser le répertoire des récepteurs, les fonctionnalités et les spécificités antigéniques précises des lymphocytes T spécifiques de Mtb chez les patients traités pour la TB. Ce projet d’intitiation vise à mettre au point un flux de travail innovant basé sur l’utilisation des techniques de séquençage sur cellules uniques. Pour ce faire, les lymphocytes circulants spécifiques de Mtb seront sélectionnés de manière exhaustive et non-biaisée avec un large panel de peptides Mtb couplés aux molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), multimérisées et marquées avec des code-barres oligonucléotidiques. Chaque panel sera personnalisé en fonction des allèles du CMH du patient (au cours de ce projet l’allèle  fréquente A2 sera exploré) et de l’isolat clinique de Mtb correspondant. Par cette approche de médecine personnalisée de la TB nous allons promouvoir la détection d’antigènes rares de Mtb et de lymphocytes T spécifiques de Mtb rares, mais pertinents pour la réponse immunitaire protectrice contre la TB et pour des futurs vaccins.

Une fois mis au point et validé, ce flux sera appliqué afin d’explorer une plus large cohorte de patients. L’accomplissement d’une telle étude permettra de caractérises des lymphocytes T protectrices anti-Mtb et de nouveaux peptides immunogènes de Mtb, offrant ainsi de nouvelles perspectives de développement de HDT dans la tuberculose.

L’intégration rétrovirale est catalysée par une structure oligomérique et dynamique appelée intasome, composée de l’intégrase et de l’ADN viral, associés à des partenaires viraux et cellulaires. L’association finale intasome/chromatine régit l’efficacité de l’intégration du génome viral. Par ailleurs, l’environnement chromatinien du site d’intégration proviral détermine l’expression des gènes viraux. Ainsi, il est crucial de mieux comprendre le processus engagé dans cette étape de la réplication virale pour développer de nouvelles thérapies antivirales originales, ou de nouvelles approches permettant de réorienter l’intégration vers des régions moins favorables de la chromatine.

Malgré les données structurales récemment acquises sur les intasomes rétroviraux, aucune structure de complexe formé entre l’intasome du VIH-1 et son substrat chromatinien n’est disponible contrairement à PFV. Nos données récentes indiquent qu’une raison probable de cet échec est liée à un ancrage différent de cet intasome sur la chromatine qui l’engagerait dans une structure spécifique encore inconnue.

L’originalité de notre projet est d’aborder ces questions encore obscures sur l’association entre l’intasome du VIH-1 et le site d’intégration sur la chromatine de l’hôte en visant à obtenir des informations inédites sur la structure fonctionnelle du nucléo-complexe impliqué dans l’interaction entre les génomes (viral et cellulaire) ainsi qu’à élucider la question du rôle de cofacteurs cellulaires dans ce processus. Le but principal est d’obtenir les premières structures à résolution atomique du complexe intasome/chromatine du VIH-1 validées fonctionnellement.

Dans ce projet, nous i) déterminerons le substrat de chromatine optimal pour l’intégration du VIH-1 en utilisant des tests d’intégration in vitro et des approches d’assemblage de la chromatine maîtrisés par l’équipe partenaire 2 (Parissi, MFP Bordeaux). ii) Le substrat nucléosomal optimal ainsi identifié sera ensuite caractérisé dans des approches biophysiques et structurales de cryo-microscopie (CryoEM) dans l’équipe coordinatrice 1 (Ruff, IGBMC, Strasbourg), experte du domaine, afin d’identifier les déterminants moléculaires de l’interaction intasome/nucléosome et les interfaces fonctionnelles intasome/nucléosome. iii) Ces interfaces seront ensuite validées fonctionnellement par mutagenèse dirigée de l’intégrase (IN) réalisée sur des vecteurs lentiviraux dérivés du VIH-1 afin de suivre leur rôle dans l’efficacité d’intégration et son ciblage vers les différentes régions chromatiniennes par des tests d’infectiosité et séquençage des sites d’intégration réalisés dans l’équipe partenaire 3 (Negroni, IBMC, Strasbourg). iv) L’impact des variations génétiques de l’IN sur ces interfaces sera étudié en comparant différentes formes circulantes et différents sous-types du VIH-1 afin d’obtenir des données sur l’évolution des souches virales ainsi que de prévoir les prochaines émergences de variants possibles (équipe 3). Enfin, v) les données de structure/fonction obtenues dans ce projet serviront de base à la sélection et à la conception rationnelle de nouveaux composés chimiques inhibiteurs ciblant ces interfaces intasome/nucléosome afin de bloquer et/ou de recibler l’intégration (équipes 1, 2 et 3).

Les objectifs de notre projet s’organisent en quatre principaux volets interconnectés qui pourront être développés en parallèle. Les données fonctionnelles viendront enrichir les approches biophysiques et structurales en permettant la sélection des meilleurs candidats pour ces analyses. Les données structurales acquises serviront pour réajuster les études fonctionnelles afin d’affiner nos résultats. L’ensemble de ces données servira de base pour le design de drogues ciblant spécifiquement les interfaces intasome/nucléosome fonctionnelles ainsi définies.

Notre projet permettra ainsi de mieux définir l’environnement chromatinien du site d’intégration dont dépend l’expression du génome viral, de mieux contrôler le ciblage des complexes d’intégration vers ces sites et ainsi définir de nouvelles voies de contrôle de l’intégration lentivirale et de la latence virale (stratégie block and lock).

Les thérapies anti-rétrovirales traitent efficacement les infections au VIH. Cependant, l’arrêt du traitement entraîne un rebond viral et le traitement doit donc être poursuivi à vie, avec des risques importants. Les rebonds viraux sont provoqués par des cellules infectées de manière latente, qui peuvent être réactivées même après des années de traitements. De plus, alors qu’une variable médicale clé pour développer une cure est la vitesse à laquelle les cellules latentes se réactivent, nous savons très peu de choses sur la transcription virale dans les cellules latentes. Des données récentes indiquent que la sortie de latence est stochastique, ce qui reflète les fluctuations aléatoires de la transcription observées dans les cellules vivantes. Sachant que la plupart des gènes ne sont transcrits qu’épisodiquement, nous pensons que certaines cellules latentes ne sont pas complètement silencieuses mais expriment le virus de manière transitoire, lors de brèves impulsions, et donc de manière indétectables avec des méthodes conventionnelles. Ces cellules latentes pourraient être des facteurs clés de l’infection car elles pourraient échapper à la surveillance immunitaire et déclencher deux types d’événements: (i) des sursauts sporadiques de transcription virale, trop faibles pour activer complètement le virus mais néanmoins produisant suffisamment de virus pour déclencher un nouveau cycle infectieux; (ii) une sortie de latence, dans laquelle une impulsion produit suffisamment d’ARN pour initier la boucle de rétroaction de Tat, et donc pour activer complètement le virus. Ces événements stochastiques pourraient être dus à un bruit intrinsèque, créé par la stochasticité inhérente aux réactions biochimiques de l’initiation de la transcription, ou à un bruit extrinsèque, qui est généré par des facteurs affectant l’ensemble de la cellule, comme une activation aléatoire d’une voie de signalisation, un stress mécanique, etc…

          Dans ce projet, nous exploiterons la puissance de l’imagerie de molécule unique pour étudier la transcription virale dans les cellules infectées de manière latente par le VIH-1. Nous avons précédemment développé des systèmes permettant de visualiser des molécules uniques d’ARN viral dans des cellules vivantes, et ces méthodes sont parfaitement adaptés pour détecter les rares événements de transcription virale qui se produisent dans les cellules latentes. Grâce à de l’imagerie de cellules vivantes à haut débit, nous déterminerons:

• But 1: l’activité transcriptionnelle virale dans un grand nombre de cellules T latentes;
• But 2: l’hétérogénéité de la réponse virale à l’activation cellulaire;
• But 3: la contribution des facteurs extrinsèques et intrinsèques à ces évènements de transcription.

Ce projet offrira une vision renouvelée de la latence virale et aidera à concevoir des stratégies plus efficaces pour combattre le virus.

Comme la plupart des virus à ADN et certains virus à ARN, le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) se réplique uniquement dans le noyau et a donc développé tous les éléments nécessaires pour détourner la machinerie cellulaire pour son transport à travers le pore nucléaire. De manière intrigante, il semblerait que la capside virale, qui est un assemblage d’hexamères et de pentamères de CA, et dont on pensait à l’origine qu’elle était désassemblée dans le cytoplasme, joue en fait un rôle clé dans l’import nucléaire et entre dans le noyau avec le génome viral. Dans une publication récente, nous avons identifié un signal de localisation nucléaire (NLS) atypique dans une boucle exposée de CA qui est spécifiquement reconnu par la beta-karyophérine Transportin (également appelée TRN-1/nom de gène TNPO1) (Fernandez et al., Nat Microbiol 2019). La liaison de la TRN-1 aux hexamères de CA permet l’import nucléaire du VIH-1 et déclenche la décapsidation. Notre étude a identifié, à la fois sur CA et TRN-1, des résidus clés pour l’interaction. Par conséquent, en utilisant la modélisation informatique, nous avons passé au crible des chimiothèques enrichies en inhibiteurs d’interaction protéine-protéine pour trouver des molécules qui pourraient se lier à l’interface TRN-1::CA. Nous avons identifié 40 molécules que nous avons testées sur cellules indicatrices d’infection. Cela nous a permis d’identifier un inhibiteur potentiel de l’import nucléaire du VIH-1, appelé H27, ainsi que plusieurs analogues structuraux. L’objectif du projet est de caractériser les mécanismes d’action de H27 et de ses analogues en (1) examinant leur spécificité, (2) évaluant leur effet sur la stabilité et la décapsidation du VIH-1, (3) vérifiant que leur effet est dépendant de TRN-1 et (4) améliorant les molécules pour atteindre une meilleure IC50 et déterminer les relations structure-fonction. La capside du VIH-1 est depuis longtemps considérée comme une cible thérapeutique, et plusieurs inhibiteurs ciblant la protéine CA ont déjà été décrits. Si notre projet aboutit, nous identifierons une nouvelle classe d’inhibiteurs de la capside du VIH, qui bloquent l’interface TRN-1::CA. Nous espérons qu’ils pourront agir comme de puissants inhibiteurs de l’import nucléaire, soit spécifique du VIH-1, soit aussi d’autres virus qui dépendent également de TRN-1 pour leur désassemblage et/ou import nucléaire, tels que le virus de la grippe. Nous espérons également qu’en élucidant le mode d’action de ces molécules nous comprendrons davantage comment TRN-1 coordonne le transport nucléaire et le désassemblage de capsides virales en cellules infectées.

La résistance, la tolérance et la persistance sont trois phénomènes par lesquels les bactéries peuvent échapper—de façon permanente (résistance) ou transitoire (tolérance et persistance)—au pouvoir bactéricide d’un antibiotique. Aussi, la tolérance et la persistance compliquent le traitement des infections bactériennes, dont la tuberculose : elles allongent la durée des traitements, sont responsables des rechutes d’infection, et contribuent au développement de résistance. Cibler les bactéries tolérantes et persistantes pourrait donc améliorer les traitements et limiter l’antibiorésistance. Cependant, ceci nécessite une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires bactériens sous-jacents et de la contribution de l’immunité de l’hôte dans ces phénomènes.

Tolérance et persistance augmentée—qui réfère à une augmentation de la proportion de bactéries persistantes dans une population—peuvent être causées par l’acquisition d’une mutation stable. L’étude de tels mutants permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires engagés par les bactéries pour survivre de façon transitoire au traitement antibiotique, mais l’isolation de ces mutants est souvent rendue difficile par la présence de bactéries résistantes capable de croitre en présence d’antibiotique. Aussi, nous avons développé une méthode—appelée ReMIND pour « Recombination Mediated Isolation of Non Dividers –pour enrichir et sélectionner les bactéries qui survivent mais ne poussent pas en présence d’antibiotique et les discriminer des bactéries résistantes. Le travail proposé ici vise à établir une preuve de concept que ReMIND peut être utilisé in vitro et dans des macrophages –la niche préférée de Mycobacterium tuberculosis—pour isoler des mutants tolérants et à persistance augmentée. A plus long terme, cette méthode nous permettra d’étudier le rôle des mécanismes immunitaires de l’hôte dans l’émergence de tolérance et persistance chez Mycobacterium tuberculosis. En combinaison avec les traitements antituberculeux actuels, les voies de signalisation de l’hôte qui favorisent l’apparition de bactéries tolérantes ou persistantes pourraient donc faire l’objet de thérapies dirigées contre l’hôte pour prévenir l’apparition d’antibiorésistance. Par ailleurs, nos futurs travaux pourront aussi permettre d’identifier des cibles mycobactériennes dont l’inhibition aura le potentiel de raccourcir la durée du traitement antituberculeux, diminuer les taux de rechute et réduire le développement de résistance. Enfin, puisque la survie augmentée précède la résistance per se, l'approfondissement de nos connaissances sur les mutations favorisant la tolérance et/ou la persistance augmentée pourrait permettre de prédire—d’un point de vue probabiliste—et d’anticiper l’apparition de résistance génétique chez des patients traités.