Winning projects and candidates

Contexte :

La protéine régulatrice Rev du VIH-1, est une protéine nucléocytoplasmique de liaison à l’ARN, essentielle à la réplication virale. Rev est responsable de l’export nucléaire des ARN viraux non ou partiellement épissés, qui codent pour les protéines structurelles et enzymatiques virales et constituent l’ARN génomique incorporé dans les nouvelles particules virales. Rev est importée dans le noyau par le facteur de transport nucléaire de la cellule hôte, Importin β (Impβ). L’interaction entre Rev et Impβ est directe, et son inhibition bloque l’importation nucléaire de Rev et la réplication virale. Malgré le rôle essentiel du complexe Impβ/Rev dans le cycle d’infection virale, la base moléculaire de cette interaction reste mal comprise.

Objectif :

L’objectif à long terme de ce projet est de comprendre, à l’échelle atomique, comment Rev est importée dans le noyau de la cellule hôte. Pour atteindre cet objectif, nous cherchons à obtenir une structure 3D à haute résolution du complexe Impβ/Rev par cryo-microscopie électronique (cryo-ME). Nos efforts pour obtenir cette structure, en utilisant des méthodes conventionnelles, se sont jusqu’à présent avérés infructueux en raison de la petite taille et de la pseudo-symétrie du complexe Impβ/Rev. Pour surmonter ces obstacles, nous proposons une approche innovante, basée sur l’expérience que nous avons développée au sein du laboratoire, qui consiste à fusionner génétiquement Impβ à une protéine modèle dimérique. L’objectif spécifique du contrat d’initiation est de démontrer la faisabilité de cette approche, en déterminant une structure cryo-ME initiale du complexe Impβ/Rev à une résolution subnanométrique (idéalement inférieure à 5 Å).

Approche méthodologique :

Les données préliminaires révèlent que la fusion de Impβ au domaine de dimérisation d’une petite protéine bactérienne, EsxA de S. aureus, permet la production d’un homodimère soluble de 219 kDa, (EsxA-Impβ)2, qui forme des particules de taille et de forme attendues en microscopie électronique (ME) à coloration négative. Nos résultats montrent que cette construction initiale présente un degré de flexibilité au niveau de la liaison qui relie les deux protéines, et nécessite d’être optimisée afin d’obtenir un ensemble de particules plus homogène pour l’analyse par cryo-ME. L’optimisation sera réalisée en criblant un ensemble de mutants de délétion dans lesquels les résidus de liaison flexibles seront supprimés un par un. Chaque construction sera systématiquement exprimée et purifiée pour être caractérisée biophysiquement et visualisée par ME à coloration négative. Les constructions qui permettront d’avoir un ensemble de particules uniformes  seront ensuite analysées par cryo-ME à l’aide de notre microscope Glacios interne à l’institut, et les structures 3D correspondantes seront déterminées par analyse de particules uniques.

Résultats attendus :

L’approche développée devrait permettre d’obtenir une reconstruction cryo-ME du complexe Impβ/Rev à une résolution subnanométrique. Du fait que les hélices α sont visibles à cette résolution, et que Impβ et Rev sont des protéines hélicoïdales, ces premiers résultats nous permettront de positionner sans ambiguïté les structures atomiques connues de Impβ et Rev dans la carte cryo-ME et d’obtenir un premier aperçu de la façon dont Impβ reconnaît Rev. Il est important de souligner que ces résultats nous permettront de demander l’accès à un microscope cryo-électronique plus puissant (Titan Krios ou équivalent), qui nous permettra de déterminer une structure à haute résolution (idéalement mieux que 3 Å) qui révélera le détail des interactions impliquées dans la reconnaissance de Rev par Impβ. À plus long terme (au-delà de la portée de la présente demande de financement), nous exploiterons ces résultats pour identifier et générer des mutants qui compromettent l’interaction de Impβ et Rev. Ces mutants seront ensuite testés in vitro par des essais d’interaction et in vivo par des essais d’importation nucléaire de Rev dans des cellules, afin de confirmer l’implication des interactions moléculaires, structuralement identifiées, dans l’import nucléaire de Rev.

Objectifs : 1) réaliser un état des lieux et évaluer la faisabilité d’un projet de suivi des personnes âgées vivant avec le VIH (PAVIH) au Burkina-Faso, en Côte d’Ivoire et au Togo et 2) sélectionner les outils de collecte adaptés à la description des syndromes gériatriques chez ces personnes âgées.

Situation du sujet : Grâce au traitement antirétroviral (TARV), l’espérance de vie des personnes vivant avec le VIH a considérablement augmenté et est devenue similaire à celle des personnes séronégatives. Outre les affections liées au VIH, les PAVIH sont confrontées aux mêmes problèmes de santé que celles non infectées par le VIH telles que les comorbidités et les syndromes gériatriques. Ces comorbidités et la polymédication peuvent rendre complexe la prise en charge des PAVIH, entraînant des retards dans l’initiation du TARV dans un contexte de « test and treat » ou des changements de traitement en cas de toxicité. Par ailleurs, les syndromes gériatriques sont importants à prendre en compte car ils constituent de bons facteurs pronostiques de santé. Ainsi, le fardeau combiné du VIH, des comorbidités et des affections gériatriques dans la population en pleine expansion des PAVIH rend nécessaire un changement dans le paradigme actuel de prise en charge du VIH, afin qu’il ne se limite plus à la suppression virologique, mais permette également à la population de s’épanouir à un âge plus avancé.

Méthodes : Dans chaque pays participant, une liste des structures fréquentées par les personnes âgées sera établie et une description des données existantes dans les centres de prise en charge du VIH sur les PAVIH sera réalisée en partenariat avec les Programmes Nationaux de Lutte contre le Sida. Il s’agira notamment d’évaluer le nombre de PAVIH dans les files actives, d’établir une liste des données collectées sur elles et de décrire le format de collecte de ces données. Une réunion à Abidjan des partenaires du contrat d’initiation sera organisée pour choisir des outils de dépistage des syndromes gériatriques.  

Échéancier des travaux : Juillet 2021 : Finalisation du protocole de l’étude. Août – Septembre 2021: Description des données collectées dans chaque centre de prise en charge du VIH chez les personnes âgées. Octobre 2021: Réunion à Abidjan pour le choix des outils. Novembre-Décembre 2021 : Analyse des données et rédaction du rapport. Janvier-Février 2021 : Rédaction et soumission du projet de recherche sur les syndromes gériatriques et le parcours des soins des PAVIH à l’appel d’offre de l’ANRS de Mars 2022.

Résultats attendus :

• Déterminer la faisabilité d’un suivi des personnes âgées selon le statut VIH au Burkina Faso, en Côte d’Ivoire et au Togo ;
• Organiser la collecte des données nécessaires pour mettre en place un suivi spécifique des PAVIH ;
• Identifier des outils simples, faciles à utiliser pour le dépistage des syndromes gériatriques ;
• Rédiger le projet de recherche et la demande de financement à l’ANRS sur le parcours des soins, la prévalence et l’incidence des syndromes gériatriques et les problèmes de prise en charge des personnes âgées infectées par le VIH comparativement aux personnes âgées non infectées par le VIH;
• Renforcer la coopération entre les équipes des pays du Sud et entre les équipes Nord-Sud sur la prise en charge des PAVIH et la mise en commun des données de recherche en lien avec cette thématique.

La Guyane française est une région française d’outre-mer située en amazonie. Elle fait face à plusieurs défis avec une démographie dynamique, une pauvreté touchant près de la moitié de la population et une immigration importante (plus d’un tiers de la population guyanaise est issue de l’immigration). Les personnes originaires d’Haïti représentent 59% des étrangers vivant en Guyane suite à plusieurs vagues migratoires dont une importante datant de 2015. Elles sont aussi surreprésentées parmi les personnes vivant avec le VIH (PVVIH). Un travail analysant la pente de décroissance des CD4 suggère qu’une proportion importante des contaminations par le VIH surviennent sur le territoire guyanais. Leurs conditions de vie après l’arrivée en Guyane des émigrés d’Haïti sont souvent dégradées alliant précarité financière, administrative et de l’habitat. Ces conditions pourraient augmenter le risque de rapports sexuels exposant au risque d’acquisition du VIH et des infections sexuellement transmissibles quand ils surviennent dans un contexte de vulnérabilité sociale ou sexuelle ou de rapports tarifés dans un contexte de survie. L’enquête ANRS Parcours avait mis en évidence cette vulnérabilité sexuelle parmi les immigrés d’Afrique subsaharienne vivant en Ile-de-France à l’aide d’une méthodologie biographique permettant de croiser les conditions de vie avec la sexualité des personnes.

Ainsi, le présent projet se propose de mettre en place une étude épidémiologique transversale et biographique auprès de PVVIH originaires d’Haïti et de personnes nées en Haïti déclarant ne pas être infectées par le VIH. L’étude aura pour objectif d’évaluer la fréquence des rapports sexuels à risque (dont les rapports forcés) après l’arrivée en Guyane des personnes originaires d’Haïti et leur association avec les conditions de vie et l’acquisition d’une infection par le VIH années après années. Elle cherchera aussi à mieux comprendre les conditions de vie des personnes haïtiennes après leur arrivée en Guyane, à éclairer le recours au dépistage et les déterminants des diagnostics tardifs, du délai à l’entrée en soins mais aussi et surtout du maintien en soins après le diagnostic, notamment durant la période particulière de l’épidémie du Covid 19. Un focus sera réalisé sur les hommes ayant des rapports avec d’autres hommes originaires d’Haïti, de plus en plus représentés parmi les demandeurs d’asile et parmi les PVVIH arrivées depuis 2015, à qui sera proposée une étude ancillaire phylogénétique.

A cette fin, il recrutera un groupe de PVVIH originaires d’Haïti suivis au CH de Cayenne ou de Kourou et un groupe de personnes nées en Haïti non infectées suivies en médecine générale, à la PASS ou par la Croix Rouge Française dans les communes de Cayenne, Matoury, Macouria ou Kourou. Des données sociales, démographiques, administratives, relatives au parcours migratoire, à la sexualité, au recours au dépistage, aux outils de la prévention diversifiée, à l’entrée et au maintien en soins seront recueillies. Une partie des informations sera recueilli chaque année depuis l’arrivée en France à l’aide d’une grille biographique.

Les résultats de cette étude est susceptible d’améliorer la compréhension des situations de vulnérabilité sexuelle des immigrés d’Haïti dans une optique de mise en place de parcours en santé sexuelle intégrant une offre de dépistage et de prévention médicalisée permettant de réduire le risque d’infection par le VIH, les IST, les rapports sexuels non souhaités et les grossesses non désirées, ainsi qu’une amélioration du parcours d’entrée et de maintien en soins après la découverte d’une séropositivité en Guyane. Ils s’articuleront avec le travail déjà en cours de développement d’une offre de prévention et de soins directement au sein des zones d’habitats informels où vit une population majoritairement originaire d’Haïti.

Il permettra par ailleurs de mieux comprendre le parcours des PVVIH haïtiens après leur diagnostic et de produire des informations utiles à la mise en place d’actions susceptibles de prévenir la perte de vue.

Les études sur la transmission du VIH-1 par voie sexuelle suggèrent que les virus T/F (Transmitted/Founder) à l’origine de l’infection possèdent des propriétés biologiques spécifiques leur permettant d’être transmis. Cependant, des incertitudes persistent sur les éléments phénotypiques particuliers associés à leur sélection.  Au niveau du tractus génital, les macrophages (MP) et les lymphocytes T CD4+ (LTCD4) font partie des premières cellules immunitaires cibles des virus T/F. L’infection de ces cellules cibles peut se faire par les virus libres circulants mais la transmission des virions entre cellules infectées et cellules cibles semble plus efficace pour la dissémination du VIH-1. Malgré l’importance des macrophages dans l’infection VIH, les mécanismes conduisant à leur infection et à leur capacité à transmettre des virions infectieux restent méconnus. Dans le contexte de transmission du VIH-1 par voie sexuelle et en tenant compte du rôle prépondérant des MP au niveau des sites de transmission, la comparaison des virus T/F issus d’un transfert intercellulaire pourrait contribuer à la compréhension du processus de transmission des virus à l’origine d’une nouvelle infection.

Afin de mieux caractériser le rôle des MP dans l’établissement de l’infection initiale, nous proposons de comparer les propriétés infectieuses de virus T/F issus de différents transferts cellulaires impliquant les MP et les LTCD4.

Pour cela, nous utiliserons deux populations d’étude. La première population d’étude correspond à un panel de 10 clones moléculaires infectieux de virus T/F de sous-type B obtenus auprès du NIH (NIH Aids Reagent Program). Ce panel de virus T/F bien caractérisé nous permettra de rechercher si le passage de ces virus dans des macrophages par transfert intercellulaire modifie leurs propriétés infectieuses. La seconde population d’étude est issue de 5 patients infectés par des variants très proches d’un virus de sous-type B et faisant partie d’un cluster de transmission que nous avons étudié précédemment. Des virus réplicatifs exprimant les enveloppes représentatives de la population virale infectant les 5 patients (6 variants T/F et 7 variants chroniques) seront générés. Cette population nous permettra de rechercher si les virus T/F présentent un avantage sélectif à transiter par les MP par rapport aux virus chroniques.

L’analyse des propriétés infectieuses des virus T/F après transit lymphocytaire ou macrophagique constitue une réelle opportunité d’apporter des éléments phénotypiques nouveaux sur les virus impliqués dans la transmission de l’infection et de comprendre le rôle des MP dans la dissémination du VIH-1, avec en perspective le développement de mesures préventives adaptées.

Le virus de l’hépatite Delta (VHD) est un agent pathogène humain unique. Il a été découvert en 1977 par le Pr M. Rizzetto qui a mis en évidence un nouvel antigène « Delta » (HDAg) dans le sérum de patients italiens atteints d’une forme grave d’hépatite liée au virus de l’hépatite B (VHB). Le VHD est un virus défectif, nécessitant l’antigène de surface du VHB (AgHBs) pour son cycle viral.  La particule virale Delta, d’un diamètre d’environ 36 nm est constituée, d’une enveloppe portant l’AgHBs du VHB au sein de laquelle on retrouve une ribonucléoprotéine composée du génome ARN Delta associé à deux isoformes de la protéine VHD, la petite s-HDAg et la grande L-HDAg. Cet ARN, souvent comparé à celui des viroïdes, est un ARN simple brin circulaire négatif d’environ 1700 nucléotides qui possède une structure « pseudo double brins » avec près de 70% d’appariements interne. Au cours du cycle viral, des modifications de séquences du génome peuvent apparaitre en lien avec plusieurs facteurs, tels que l’ARN polymérase 2 de l’hôte (ARN-Pol2) nécessaire à sa réplication, l’adénosine désaminase humaine agissant sur l’ARN double brin (ADAR-1) générant en particulier une mutation en position 1012 du génome, la pression de sélection du système immun de l’hôte et d’éventuels évènements de recombinaison même s’ils ont été très peu décrits. Le génome du VHD se caractérise donc par une grande variabilité génétique pouvant atteindre 40% de sa séquence complète. Sur la base de la divergence de séquence nucléotidique établie par des analyses phylogénétiques, nous avons précédemment proposé la classification du genre VHD en 8 génotypes principaux (1 à 8) incluant plusieurs sous génotypes. Très récemment, plusieurs génomes pseudo-analogues du VHD humain ont été identifiés chez d’autres espèces (serpents ; amphibiens ; oiseaux) avec une similarité de séquence inférieure à 50% en comparaison avec le génome du VHD humain, relançant ainsi le débat sur l’origine du VHD et de ses génotypes. Quelques études menées ces dernières années ont essayé de dater l’histoire de la propagation et de l’évolution génétique du VHD en se restreignant uniquement au génotype 3, localisé dans le bassin amazonien. La date et l’origine géographique de la souche commune aux 8 génotypes et sous génotypes est donc toujours inconnue. Des travaux très préliminaires d’analyses phylogénétiques et d’horloge moléculaire associant 3 équipes (CHU Avicenne, CHU Mondor/Unité INSERM U955 et London School of Hygiene & Tropical Medicine) ont montré, à partir d’une base de données de 153 génomes complets datés, que le VHD pourrait avoir une origine très ancienne mais une diversification des génotypes beaucoup plus récente. Cependant les incertitudes de calculs liées à la complexité du génome delta et à sa variabilité ainsi qu’au manque de séquence pour certains génotypes nécessitent des travaux complémentaires bio-informatiques complexes et de séquençage de nouvelles souches. Ce projet a donc pour objectif de caractériser par séquençage NGS, le génome complet de 200 nouvelles souches de différents génotypes VHD à partir de la collection du CNR associé delta. Les génomes complets obtenus seront ajoutés à la banque de données actuelle en vue de conduire une série d’analyses phylogénétiques, phylogéographique et de datation moléculaire. La phylogénie des séquences virales sera reconstruite en vue d’inférer et de comprendre les grandes étapes de l’histoire évolutive du VHD, dans son ensemble et par génotype, utilisant des approches de maximum de vraisemblance ou d’inférence Bayesienne, bien établies dans le champs de la recherche en évolution moléculaire. Des outils statistiques permettant de détecter les recombinaisons génomiques et l’adaptation moléculaire seront aussi employés en vue de caractériser plus en détail la diversité génétique du virus. Le taux d’évolution du VHD, la datation de son origine ainsi que des grands évènements de diversification qu’il a subi au cours du temps seront estimés par datation moléculaire par inférence Bayesienne. Des analyses phylogéographiques permettrons de déterminer l’histoire migratoire du virus au cours du temps, depuis son origine jusqu’au présent.

L'essai ANRS 0029s – SimpPrEP, randomisé, ouvert et contrôlé, a pour objectif d’évaluer une nouvelle méthode de prévention du VIH à la demande chez les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH), en utilisant un schéma simplifié de PrEP. Cette méthode consiste à prendre une seule dose d'une association médicamenteuse (ténofovir alafénamide – emtricitabine, TAF/FTC) avant et après les rapports sexuels ("1-1"), au lieu du schéma actuel "2-1-1" de ténofovir disoproxil – emtricitabine (TDF-FTC) à la demande. Comparé au TDF, le TAF entraîne des niveaux plus élevés et plus durables de la forme active du médicament (ténofovir diphosphate, TFV-DP) dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), un facteur essentiel de l'efficacité à long terme de la PrEP. Dans une étude précédente menée dans la cohorte ANRS PREVENIR, notre groupe a utilisé un modèle d'infection ex- vivo du tissu rectal et a montré que la protection précoce contre le VIH au niveau des muqueuses, 2 heures après la prise d'une dose de charge de deux comprimés de TDF/FTC, était principalement due à des niveaux élevés d'emtricitabine triphosphate (FTC-TP) dans le tissu rectal. Alors qu'une dose unique de TAF/FTC entraîne des niveaux plus élevés de TFV-DP dans les PBMC, elle entraîne également des niveaux plus faibles de FTC au niveau des muqueuses par rapport à une double dose de TDF/FTC. Dans cette étude, notre objectif est d’étudier l'impact des différents profils pharmacocinétiques d’une dose TAF/FTC comparé à deux doses de TDF/FTC sur la protection contre le VIH-1 au niveau des muqueuses et au niveau systémique (en utilisant une infection ex vivo des PBMC) après une exposition précoce au VIH afin de mieux comprendre l'importance relative de la protection au niveau des muqueuses par rapport à la protection systémique en tant que facteur de risque de transmission du VIH-1.

Situation du sujet et problématique. Les inhibiteurs de protéase du VIH font partie des combinaisons antirétrovirales de référence utilisées pendant la grossesse pour traiter les femmes et prévenir la transmission mère-enfant du VIH. Plusieurs études de cohorte et deux essais randomisés ont mis en évidence une augmentation du risque d’accouchement prématuré associé à l’utilisation de certains IP par rapport aux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse. Les mécanismes sous-jacents de ces résultats ne sont pas connus. Une des hypothèses physiopathologiques est que cet effet serait médié par une baisse de la progestérone plasmatique, car il est connu que la baisse de la progestéronémie en fin de grossesse est associée à la parturition. Une équipe canadienne a décrit l’effet des inhibiteurs de protéase sur la production trophoblastique de progestérone in vitro, dans un modèle murin, et chez 27 femmes enceintes infectées par le VIH traitées et 17 témoins non-infectées. Les résultats montrent que la progestéronémie étaient plus faible en cas de traitement par inhibiteurs de protéase. Les taux circulants de progestérone mais aussi de ces précurseurs et catabolites sont régulés par de nombreuses voies, endocrines, paracrines.

Objectif. L’objectif principal est d’étudier les relations entre les taux circulants de progestatifs (principalement la progestérone) et l’exposition à différents types de traitements antirétroviraux pendant la grossesse, et leur rôle éventuel dans la relation entre antirétroviraux et prématurité. L’objectif secondaire est de mettre en évidence quelles enzymes de la stéroïdogénèse placentaire seraient modulées en étudiant les profils stéroïdiens circulant dans leur ensemble.

Méthodes. Nous utiliserons plusieurs sources de données pour étudier des expositions diverses, et pouvoir les comparer entre elles : (1) la biothèque de l’enquête périnatale française EPF-ANRS CO1 CO11, total de 1117 prélèvements ; (2) la biothèque de l’essai contrôlé randomisé PRIMEVA ANRS (190 prélèvements) ; (3) les prélèvements issus de l’essai ANRS 168 MONOGEST (270 prélèvements recueillis au sein d’une sous-étude endocrine prévue dans le protocole) ; (4) biothèque du laboratoire d’hormonologie de l’hôpital Cochin, chez des patientes non infectées par le VIH (200 prélèvements). Les aliquotes de plasma seront acheminés vers le laboratoire d’hormonologie de l’hôpital Cochin pour la réalisation des dosages. Les profils stéroïdiens seront étudiés par spectrométrie de masse (LC-MSMS). Des comparaisons par test de Student et par régression linéaire en ajustant sur l’âge gestationnel au moment du prélèvement seront réalisées entre les différents groupes d’exposition.