Winning projects and candidates

Le cancer du col de l’utérus reste le premier cancer dans le monde et la deuxième cause de décès par cancer chez les femmes.

En France, lorsque des lésions malpighiennes intra-épithéliales de haut grade sont diagnostiquées lors du dépistage du cancer du col de l’utérus, il est recommandé de procéder à une résection chirurgicale de la lésion diagnostiquée par prévention, sachant qu’environ 12 % de ces lésions évolueront vers un cancer invasif du col de l’utérus. En revanche, pour les lésions malpighiennes intraépithéliales de bas grade (LSIL), une surveillance annuelle par colposcopie n’est recommandée qu’en raison de la grande proportion de ces lésions qui régressent spontanément (environ 60 %). Cependant, malgré une classification histologique des lésions cervicales, nous ne disposons pas encore de marqueurs prédictifs et plus précis permettant de sous-catégoriser les LSIL et HSIL cervicales en fonction de leur évolution (stabilisation/régression/aggravation).  Des études transversales approfondies des tissus cervicaux prétumoraux et tumoraux pourraient permettre de définir une carte d’identité plus précise des prénéoplasies cervicales et de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de l’évolution des lésions.

Description du projet :

Nous proposons une approche globale multi-intégrée, se concentrant sur les éléments génomiques, viraux (100% de ces lésions cervicales sont induites par le HPV), immunologiques et épigénétiques pour décrire les différentes LSIL évolutives comparées aux HSIL appariées et au cancer invasif du col de l’utérus à des stades précoces. Par cette approche globale, nous proposons d’étudier une cohorte rétrospective de femmes diagnostiquées histologiquement avec une lésion prétumorale et tumorale jusqu’en 2015 dans le service de chirurgie gynécologique et cancérologique du sein de l’Hôpital Européen Georges Pompidou (HEGP).

Résultats

Ces approches pourraient ouvrir la voie à l’identification d’une signature prédictive intégrée de l’évolution. Une telle signature pourrait être très utile dans la prise en charge médicale des femmes et pourrait identifier un composant moléculaire à cibler pour stimuler la régression ou stopper l’aggravation.

Principales étapes 

Étape 1 : Sélection des patientes appariées et récupération des échantillons (6 mois)
Étape 2 : Réalisation des expériences (12 mois)
Étape 3 : Mise à jour finale des données cliniques et analyse globale (6 mois)

Résultats attendus

Tout d’abord, ce projet pourrait permettre de décrire par un profil moléculaire, viral et immunologique complet les lésions cervicales prétumorales et tumorales. De plus, cette étude moléculaire et immunologique approfondie et complète des prénéoplasies quant à leur évolution (stabilisation, régression ou progression) pourrait également permettre de mettre en évidence des profils particuliers qui pourraient représenter un complément intéressant à la classification histologique classique en définissant plus précisément les lésions et leur évolution potentielle.

Nous pensons que cette étude basée sur une analyse virale et cellulaire complète en étudiant les modifications épigénétiques, les profils transcriptomiques, le WES, la signature moléculaire HPV et le microenvironnement immunologique, permettra de décrire une ” carte d’identité ” moléculaire précise de chaque lésion cervicale prétumorale et tumorale induite par HPV en corrélation avec leur évolution clinique. Cette carte d’identité pourrait éventuellement être utilisée pour permettre l’ultrastadification des lésions cervicales prétumorales en fonction de leur évolution et pour sélectionner celles qui doivent être réséquées chirurgicalement ou non.

Enfin, en apportant une meilleure compréhension cognitive des mécanismes oncogéniques, ces données avec une description complète des lésions prétumorales comparées aux lésions tumorales pourraient être un tremplin et guider d’autres études plus fondamentales sur les mécanismes potentiels impliqués dans l’évolution de ces lésions et ainsi identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Daxx est une protéine chaperonne, majoritairement nucléaire, impliquée dans de nombreux processus cellulaires, comme l’apoptose et la répression transcriptionnelle. Lors de travaux antérieurs, nous avons identifié cette protéine comme un facteur de restriction capable d’inhiber la réplication du VIH-1. Le mécanisme d’action de Daxx est particulièrement original, puisque l’infection par le VIH-1 provoque la translocation de Daxx du noyau vers le cytoplasme. De façon intrigante, d’autre rétrovirus non humains déclenchent aussi la translocation de Daxx, mais pas le virus de la grippe (un orthomyxovirus) ou le virus de la stomatite vésiculaire (un rhabdovirus). Récemment, nous avons démontré que l’infection par le SARS-CoV-2 induisait également la sortie de Daxx du noyau et que celui-ci inhibait alors la réplication du virus.

Dans le cas du VIH-1, nous avons démontré que c’est la rétro-transcription qui déclenche le signal induisant la translocation de Daxx, mais la nature de ce signal est cependant inconnue.

Une fois dans le cytoplasme, Daxx interagit, via son domaine de liaison à SUMO (SIM, pour “SUMO interacting motif) avec les capsides entrantes et recrute un complexe multi-protéique qui empêche leur décapsidation. Par ailleurs, nous avons des résultats préliminaires suggérant que Daxx est également incorporée dans les particules virales et inhibent leur réplication.

Toutes ces observations soulèvent de nombreuses questions sur le mécanisme de restriction virale médiée par la protéine Daxx et notamment sur les déterminants viraux et cellulaires qui déclenchent sa sortie du noyau et son encapsidation dans les particules virales. Notre projet de recherche vise à lever le voile sur ces zones d’ombre.

Nous étudierons donc tout d’abord la localisation subcellulaire de Daxx au cours de l’infection VIH-1, par une approche d’imagerie en temps réel, afin d’identifier quelle voie de signalisation déclenche la translocation de Daxx. Nous identifierons également les déterminants viraux permettant à Daxx d’être encapsidée dans les particules virales, ainsi que le mécanisme qui permet à Daxx d’interférer avec l’infectivité de ces particules. Ces aspects seront notamment évalués dans les principales cellules-cibles du VIH-1, afin de comparer l’expression de Daxx, sa propension à être encapsidée et les conséquences de son encapsidation sur la réplication virale. D’autres pistes de recherche seront également explorées. En particulier, étant donné que Daxx interagit avec la capside du VIH-1 via son domaine SIM et que nos résultats préliminaires font suspecter une interaction directe de Daxx avec la cyclophiline A (CyPA), nous étudierons si cette protéine cellulaire liée à la capside du virus, est SUMOylée. Enfin, nous évaluerons si le domaine D/E de Daxx est impliqué dans son activité anti-VIH. En effet, ce domaine a récemment été identifié comme étant capable de reconnaitre les protéines mal repliées et ainsi permettre à la protéine Daxx de restaurer leur conformation. Il est tentant d’imaginer que cette activité ” disaggregase” de Daxx pourrait être impliquée dans son activité antivirale.

Notre projet de recherche permettra de répondre à des questions cruciales relatives à l’activité antivirale de Daxx et de mieux comprendre les relations complexes que le virus entretient avec cette protéine cellulaire. Élucider le mécanisme d’action de Daxx constitue un important défi de la recherche sur les défenses antivirales, contre le VIH-1, mais également contre d’autres virus pathogènes.

L’épitranscriptomique et son contrôle sur la réplication virale est un domaine émergent. Son rôle dans la réplication du VIH est indiscutable, mais ses modes d’actions restent inconnus. La méthylation des N6 des adénines (m6A) est l’une des modifications importantes de l’ARN affectant l’expression des gènes cellulaires et viraux. Il a été démontré que l’ARN génomique du VIH est méthylé principalement dans les régions 5 ‘et 3’ non traduites ainsi que dans le RRE et la région codante Gag. Des résultats préliminaires provenant du laboratoire de notre collaborateur R. Soto-Rifo suggèrent fortement que la méthylation des N6A et sa dynamique jouent un rôle important dans la transition de la traduction des polyprotéine Gag et Gag-pol à l’encapsidation de l’ARN génomique. En effet, contrairement à l’encapsidation de l’ARNg, ceux présents dans le cytoplasme sont méthylés dans le 5’UTR. Dans ce projet, nous suivrons une approche multidisciplinaire pour caractériser l’impact de la méthylation du N6 des Adenines sur différents aspects interconnectés du cycle de vie du VIH-1. Nous évaluerons l’effet de m6A sur la structure de l’ARNg, sa dimérisation pré-encapsidation ainsi que sur la synthèse des polyprotéines Gag et Gag-pol. Ceci sera réalisé de manière synergique à la fois in vitro et in cellulo. Pour ce faire, des outils (chimiques et biochimiques) seront développés pour reproduire in vitro la méthylation spécifique des adénosines en position N6, ainsi que pour suivre et caractériser la méthylation m6A dans les cellules. En effet, le procédé actuel permettant de détecter les m6A dans une séquence d’ARN est trop imprécis. Cette même technologie sera également utilisée pour caractériser les methylations dans le génome de l’hôte. La capacité à marquer enzymatiquement l’ARN in vitro permettra de préparer des séquences d’ARN du VIH-1 qui seront soumises à des essais de dimérisation, au sondage de la structure par SHAPE ou à des essais de traductions in vitro et in vivo. En parallèle, la méthylation N6A du VIH-2 in cellulo sera caractérisée pour doter notre étude d’un raisonnement phylogénétique. Suivant la même chimie, notre collaborateur M. Ethève-Quelquejeu aura pour objectif de développer des agents chimiques permettant de piéger des protéines spécifiquement assemblées sur les sites m6A de l’ARN génomique du VIH-1. Ces outils seront utilisés pour définir les complexes protéiques responsables du processus de régulation. Enfin dans les dernières étapes du projet nous utiliserons cette nouvelle méthodologie pour obtenir des ARN fluorescents, ce qui nous permettra de suivre les déplacements de l’ARN viral dans la cellule. Le succès du projet nécessitera la collaboration étroite des trois équipes qui apportent chacune des compétences spécifiques. L’agrégation des résultats définira l’influence de m6A sur les différentes étapes du passage de la traduction à l’encapsidation, l’objectif final étant de comprendre comment la méthylation des N6A régule cet aspect du cycle viral. Les résultats préliminaires sur l’encapsidation de l’ARNg, ainsi que sur les propriétés de structure et de dimérisation de l’ARN du VIH complètement méthylé, ne laissent aucun doute sur l’importance de m6A sur la réplication du VIH-1. Bien que certaines des étapes de recherche proposées soient novatrices, elles se situent dans la gamme des compétences de chacune des équipes et nous ne prévoyons pas de difficultés majeures. Pour les incertitudes identifiées, principalement concernant l’application in vivo des outils chimiques, elles sont étayées par une approche la plus sûre, partiellement in vitro. Au final, nous pensons que notre étude apportera des éléments de réponse sur une question importante concernant le cycle de vie du VIH-1 qui est resté ouverte depuis 40 ans : quelles sont les facteurs déclenchant le passage de la traduction à l’encapsidation de l’ARNg.

Les carcinomes hépatocellulaires (CHC) sont les tumeurs hépatiques primitives du foie les plus fréquentes devant les cholangiocarcinomes. L’infection par le Virus de l’Hépatite B (VHB) est un facteur de risque majeur des CHC. Néanmoins, la co-existence fréquente d’autres facteurs de risque associés au CHC, comme l’infection par le VHC, le VHD, ou la consommation d’alcool, rend difficile l’étude de l’impact du VHB sur le CHC et, en particulier sur le microenvironnement immunitaire tumoral. L’infection par le VHB est un problème de santé publique majeur en Asie notamment, car la prévalence y est beaucoup plus importante. L’observatoire global des cancers a évalué qu’au Vietnam, le CHC est le second cancer en fréquence et la première cause de mortalité par cancer en 2022.

Au cours de nos récents travaux sur des modèles expérimentaux, nous avons émis l’hypothèse que l’expression intra-tumorale d’ARN épissées du VHB, exprimant la protéine HBSP (ARNSP1), pourrait moduler la composition et l’activité des sous populations immunitaires infiltrantes du CHC. L’impact de l’expression de l’ARN prégénomique (ARNpg) et ARNSP1 du VHB dans la tumeur n’a que très peu été étudié. Cette expression dépend notamment du degré de différentiation mais elle est indépendante de l’intégration du génome viral dans le génome cellulaire. La présence de l’ARNpg du VHB dans la tumeur a notamment été associée à une réduction de l’invasion vasculaire et à une meilleure survie. De plus, nos récents travaux suggèrent que l’infiltrat immunitaire intra-tumoral puisse varier en fonction de l’expression de l’ARNpg et de l’ARNSP1 dans la tumeur de CHC de patients, pouvant ainsi influencer l’évolution clinique et la réponse thérapeutique.

L’objectif de notre projet de recherche est d’évaluer l’impact de l’expression intra-tumorale et péri-tumorale du VHB, et en particulier de l’ARNSP1, sur le microenvironnement et l’infiltrat immunitaire (TIME) du CHC réséqué de patients Vietnamiens

Nous avons établi une collaboration avec le service de recherche clinique de l’Hôpital National du Cancer à Hanoï. Cette collaboration va nous permettre d’établir une cohorte prospective de CHC de patients sur une courte période, compte tenu de la forte incidence du CHC au Vietnam. Dans une recherche non interventionnelle, avec nos partenaires vietnamiens, cette cohorte de CHC nous permettra de caractériser le TIME de ces patients par des analyses par cytométrie en flux spectrale et par des immunohistofluorescences multiparamétrées. Cette étude sera complétée par l’exploration du contenu tumoral par des approches transcriptomiques pour analyser l’expression virale et cellulaire de façon globale et, pour certains échantillons, de façon spatiale. Enfin, les données obtenues dans ce projet de recherche pourraient soulever de nombreuses questions qui feront l’objet d’études ancillaires, explorer dans le futur avec nos partenaires vietnamiens. 

A terme, ce projet de recherche pourrait ouvrir la voie à l’intégration des données d’expression virale intra-tumorale dans le développement d’une classification multi-dimensionnelles des CHC. Il pourrait également conduire à une amélioration de la prise en charge des CHC au Vietnam.

En dépit d’énormes efforts pour le développement d’un vaccin contre le VIH-1, aucun vaccin n’a réussi pour l’instant à induire des anticorps protecteurs chez l’homme. Malgré de très grandes avancées dans la compréhension des mécanismes conduisant à la génération d’anticorps neutralisants et l’existence de très nombreuses plateformes vaccinales, protéines recombinantes stabilisées, vecteurs viraux, adjuvants innovants, etc, il y a toujours des opportunités pour tester de nouvelles plateformes vaccinales. Par exemple, une nouvelle plateforme vaccinale basée sur l’utilisation d’ARN messagers comme candidats vaccins reste encore sous explorée. Déjà prometteuse et validée dans plusieurs modèles d’infections virales, comme Zika ou influenza, la vaccination par ARN messager se heurte à la difficulté de vectoriser correctement l’ARN messager afin d’amplifier une réponse humorale de longue durée et à large spectre de protection. Les principales raisons sont liées au fait que l’injection d’ARNm induit une forte réponse innée qui peut contrecarrer la réponse adaptative et que l’ARN messager est très instable et peut s’exprimer plus ou moins bien dans une cellule cible. Nous avons récemment développé une plateforme de vectorisation d’ARN messagers, basée sur des nanoparticules biodégradables avec une couronne lipidique (lipoparticules) permettant l’expression d’ARNm dans les cellules dendritiques, après complexation avec un peptide cationique. Nous avons aussi conçu des systèmes de production d’ARN messagers et identifié des séquences stabilisatrices qui permettent une expression stable et de longue durée dans différentes cellules cibles. Dans ce projet, nous proposons d’utiliser ces expertises pour concevoir des formulations vaccinales, utilisant un ARN messager d’enveloppe du VIH-1, basée sur une protéine d’enveloppe stabilisée, et de tester leurs capacités à induire des anticorps neutralisants. Dans ce but, trois objectifs sont poursuivis : 1) Identifier une formulation vaccinale utilisant un ARN messager optimisé, capable de sur-exprimer l’enveloppe SOSIP dans des cellules présentatrices d’antigènes, tout en exposant les épitopes cibles de neutralisation, 2) Tester plusieurs molécules immuno-stimulantes, co-formulées, (Nod2, Sting, IL-21) afin de favoriser l’induction de centres germinatifs dans les ganglions drainant le site d’injection, et ainsi la production d’anticorps de forte avidité, dans un modèle souris, 3) Evaluer la capacité des meilleures formulations à induire des anticorps protecteurs à large spectre (neutralisants et non neutralisants) chez des lapins.

Ce projet, très ambitieux, repose sur un partenariat privilégié entre deux équipes d’expertises très complémentaires. En cas de succès, nous envisageons de tester rapidement chez le primate non humain cette plateforme vaccinale, qui pourrait ainsi être adaptée très facilement à d’autres maladies infectieuses.

La glycoprotéine d’enveloppe (Env) est la protéine la plus diversifiée du VIH-1. Exposée à la surface du virus sous la forme d’un trimère de gp120/gp41 et jouant un rôle fondamental dans les premières étapes du cycle d’infection, elle est la cible privilégiée des anticorps neutralisants (AcN). Cependant, une fois l’infection établie, ces AcN favorisent l’apparition de variants d’échappement et ne permettent pas de contrôler la réplication virale. Plusieurs études récentes montrent que Env est également une cible importante des protéines de l’immunité innée. Différentes protéines antivirales dont l’expression est, pour la plupart d’entre elles, induite par les interférons de type I agissent sur Env en limitant sa synthèse, en dérégulant sa glycosylation, son clivage, son incorporation dans les virions ou encore en bloquant la processus de fusion lors de l’entrée du virus dans ses cellules cibles. Néanmoins, comme pour les AcN, nos récents travaux portant sur l’étude d’un de ces facteurs (IFITM3) ont montré que certains variants viraux sont capables d’y échapper.

Si l’activité antivirale de chaque facteur de restriction a été démontrée dans des modèles de culture cellulaire in vitro, la façon dont ces facteurs coopèrent in vivoentre eux et avec les AcN, une fois la réponse immune adaptative mise en place, n’a pas été explorée. Nous proposons d’aborder cette question grâce à 2 populations d’étude. La première est constituée de 5 sujets infectés par le VIH-1 chez lesquels nous suivrons l’évolution depuis la primo-infection jusqu’au stade d’infection chronique de la sensibilité/résistance des Env aux différents facteurs de restriction et aux AcN. Ce suivi longitudinal nous permettra de mieux comprendre quelle pression exerce chaque facteur de restriction sur Env, conjointement à celle exercée par les AcN, et quel est leur impact sur l’évolution de Env. La seconde population est constituée de 4 sujets appartenant à une chaîne de transmission identifiée par des analyses phylogénétiques au sein de la cohorte PRIMO 06 de l’ANRS. Grace à nos travaux antérieurs, nous disposons pour chacun de ces patients de virus pseudotypés exprimant les Env précoces (< 3 mois d’infection) et tardives (18 ou 24 mois d’infection) de la quasi-espèce virale les infectant. Cette population nous permettra d’étudier l’impact de la pression exercée par les facteurs de restriction et par les AcN sur Env dans la sélection des variants transmis et leur adaptation à un nouvel hôte. Enfin, la comparaison de séquences d’Env résistantes ou sensibles aux facteurs de restriction et la construction d’Env mutées ou chimères devraient également nous permettre d’identifier des déterminants moléculaires de Env qui modulent sa capacité d’échappement.

Il y a environ 240 millions de porteurs chroniques du VHB dans le monde. Parmi ceux-ci, 15 à 20 millions sont co-infectés par le VHD. La surinfection des porteurs du VHB par le VHD entraîne une co-infection chronique en 90% des cas et est associée à une progression de la maladie plus grave et plus rapide et à un risque accru de CHC par rapport aux porteurs VHB. Ni les analogues nucléosidiques actuellement utilisés contre le VHB ni les thérapies à base d’interféron pégylé-alpha ne sont vraiment efficaces dans le contexte des co-infections VHB / VHD .
 Notre compréhension actuelle du cycle de vie du VHD et de son impact pathologique est très limitée et basée sur des systèmes d’expression artificielle des protéines virales. Nous utiliserons un système réplicatif de super-infection par le VHB / VHD, où nous comparerons les cultures infectées par des hépatocytes primaires infectés par le VHB, le VHD et les hépatocytes primaires super-infectés par le VHB / VHD. Nous étudierons l’empreinte métabolique du VHD. Des résultats préliminaires de notre laboratoire montrent qu’un « rewiring » des flux métaboliques vers le cycle de Krebs joue un rôle important dans l’infection par le HDV. Nos objectifs sont dans le contexte du système de surinfection VHB / VHD d’ analyser l’empreinte métabolique du HDV sur le métabolisme central du carbone par RMN et approches biochimiques conventionnelles et d’étudier la dépendance du HDV à ces changements métaboliques.

Une meilleure compréhension des réponses de la cellule hôte au HDV dans le contexte des surinfections HBV / HDV est nécessaire pour mieux comprendre la physiopathologie associée et pour développer des thérapies efficaces.