Winning projects and candidates

Contexte :

La protéine régulatrice Rev du VIH-1, est une protéine nucléocytoplasmique de liaison à l’ARN, essentielle à la réplication virale. Rev est responsable de l’export nucléaire des ARN viraux non ou partiellement épissés, qui codent pour les protéines structurelles et enzymatiques virales et constituent l’ARN génomique incorporé dans les nouvelles particules virales. Rev est importée dans le noyau par le facteur de transport nucléaire de la cellule hôte, Importin β (Impβ). L’interaction entre Rev et Impβ est directe, et son inhibition bloque l’importation nucléaire de Rev et la réplication virale. Malgré le rôle essentiel du complexe Impβ/Rev dans le cycle d’infection virale, la base moléculaire de cette interaction reste mal comprise.

Objectif :

L’objectif à long terme de ce projet est de comprendre, à l’échelle atomique, comment Rev est importée dans le noyau de la cellule hôte. Pour atteindre cet objectif, nous cherchons à obtenir une structure 3D à haute résolution du complexe Impβ/Rev par cryo-microscopie électronique (cryo-ME). Nos efforts pour obtenir cette structure, en utilisant des méthodes conventionnelles, se sont jusqu’à présent avérés infructueux en raison de la petite taille et de la pseudo-symétrie du complexe Impβ/Rev. Pour surmonter ces obstacles, nous proposons une approche innovante, basée sur l’expérience que nous avons développée au sein du laboratoire, qui consiste à fusionner génétiquement Impβ à une protéine modèle dimérique. L’objectif spécifique du contrat d’initiation est de démontrer la faisabilité de cette approche, en déterminant une structure cryo-ME initiale du complexe Impβ/Rev à une résolution subnanométrique (idéalement inférieure à 5 Å).

Approche méthodologique :

Les données préliminaires révèlent que la fusion de Impβ au domaine de dimérisation d’une petite protéine bactérienne, EsxA de S. aureus, permet la production d’un homodimère soluble de 219 kDa, (EsxA-Impβ)2, qui forme des particules de taille et de forme attendues en microscopie électronique (ME) à coloration négative. Nos résultats montrent que cette construction initiale présente un degré de flexibilité au niveau de la liaison qui relie les deux protéines, et nécessite d’être optimisée afin d’obtenir un ensemble de particules plus homogène pour l’analyse par cryo-ME. L’optimisation sera réalisée en criblant un ensemble de mutants de délétion dans lesquels les résidus de liaison flexibles seront supprimés un par un. Chaque construction sera systématiquement exprimée et purifiée pour être caractérisée biophysiquement et visualisée par ME à coloration négative. Les constructions qui permettront d’avoir un ensemble de particules uniformes  seront ensuite analysées par cryo-ME à l’aide de notre microscope Glacios interne à l’institut, et les structures 3D correspondantes seront déterminées par analyse de particules uniques.

Résultats attendus :

L’approche développée devrait permettre d’obtenir une reconstruction cryo-ME du complexe Impβ/Rev à une résolution subnanométrique. Du fait que les hélices α sont visibles à cette résolution, et que Impβ et Rev sont des protéines hélicoïdales, ces premiers résultats nous permettront de positionner sans ambiguïté les structures atomiques connues de Impβ et Rev dans la carte cryo-ME et d’obtenir un premier aperçu de la façon dont Impβ reconnaît Rev. Il est important de souligner que ces résultats nous permettront de demander l’accès à un microscope cryo-électronique plus puissant (Titan Krios ou équivalent), qui nous permettra de déterminer une structure à haute résolution (idéalement mieux que 3 Å) qui révélera le détail des interactions impliquées dans la reconnaissance de Rev par Impβ. À plus long terme (au-delà de la portée de la présente demande de financement), nous exploiterons ces résultats pour identifier et générer des mutants qui compromettent l’interaction de Impβ et Rev. Ces mutants seront ensuite testés in vitro par des essais d’interaction et in vivo par des essais d’importation nucléaire de Rev dans des cellules, afin de confirmer l’implication des interactions moléculaires, structuralement identifiées, dans l’import nucléaire de Rev.

But. Le but de ce projet est de mieux comprendre le rôle de la protéine Vpr de la lignée VIH-2/SIVsmm et de déterminer comment les protéines Vpr et Vpx de cette lignée coopèrent pour favoriser l’expression virale. Les résultats pourraient conduire à la découverte de protéines antivirales agissant à l'interface hôte-virus.

Hypothèses et résultats et préliminaires. Une partie du projet est en ligne avec nos travaux actuels qui visent à comprendre comment Vpx du VIH-2 antagonise la protéine TASOR du complexe HUSH; une autre partie est basée sur un crible protéomique quantitatif, qui a été conçu à l’origine pour comparer la façon dont les protéines virales de la famille Vpr/Vpx influencent différemment le protéome des cellules humaines et celui des cellules simiennes. Le crible a été validé avec Vpx de SIVsmm, qui induit la dégradation de HUSH.  A noter aussi que le niveau d’expression de peu de protéines est significativement diminué en présence des protéines virales, alors qu’environ 8000 protéines ont été quantifiées dans chaque condition. Parmi les protéines dont le niveau d’expression diminue en présence de Vpr de SIVsmm se trouve la protéine ZFC3H1, qui fait partie du complexe PAXT et qui interagit avec TASOR. Le complexe PAXT coopère avec l’exosome pour favoriser la dégradation des ARNs nucléaires naissants. Une deuxième protéine est également impliquée dans le métabolisme de l’ARN et, selon la littérature, pourrait être liée à ZFC3H1. Ainsi, nous faisons l’hypothèse que Vpx et Vpr de SIVsm/HIV-2 ciblent le même complexe macromoléculaire, afin de favoriser l’expression virale. Enfin, une troisième protéine, dont l’expression est très diminuée en présence de Vpr de SIVsmm, est une protéine de fonction inconnue mais identifiée précédemment en tant que facteur de restriction potentiel.

Dégradation et interaction. Nous proposons de valider et d’étudier la déplétion de ces trois candidats par Vpr de SIVsmm, mais aussi par des protéines Vpr et Vpx issues de différentes lignées lentivirales. Nous allons examiner si la déplétion dépend d’un mécanisme dépendant du protéasome et de l’utilisation de l’adaptateur de l’ubiquitine ligase DCAF1, comme pourraient le suggérer les études antérieures sur le mécanisme d’action de Vpr. Nous rechercherons des mutants de Vpr de SIVsmm (et HIV-2) incapables de diminuer l’expression des substrats. Nous testerons si les protéines de l’hôte et les protéines virales interagissent et si interaction et dégradation sont corrélées. Nous nous demanderons comment Vpr et Vpx peuvent cibler le même méga-complexe (HUSH associé aux facteurs de dégradation de l’ARN), en utilisant des mutants de troncation de TASOR et de ZFC3H1.

Rôle. Nous nous demanderons quel est le rôle de la déplétion des différents substrats par Vpr de SIVsmm (et donc probablement par Vpr de HIV-2). Nous testerons un panel de mutants de Vpr et nous nous demanderons si la dégradation d’un substrat donné corrèle avec une activité spécifique de la protéine virale (arrêt G2, dommages à l’ADN). Nous nous demanderons si la déplétion d'un substrat par siRNA, shRNA ou CrisPR, mime l'une des activités de la protéine virale. Gardant à l’esprit le rôle endogène de deux des substrats dans le métabolisme de l’ARN, nous nous demanderons en priorité si la déplétion des substrats favorise l’expression virale comme c’est le cas avec Vpx, et si Vpr et Vpx coopèrent pour améliorer l’expression virale. Nous testerons si les candidats sont connectés physiquement ou fonctionnellement. Enfin, nous testerons si la déplétion des substrats améliore la réplication des VIH-1 et 2 et des virus delta-Vpr dans les macrophages.

Conclusion. Nous espérons que ce projet conduira à une meilleure compréhension de la façon dont le VIH-2 favorise l’expression des gènes viraux en utilisant Vpx et, peut-être, Vpr. Ce projet pourrait mener à la découverte d’une fonction spécifique de Vpr du VIH-2/SIVsmm et aider à revisiter la fonction de Vpr du VIH-1. Nous espérons découvrir de nouvelles voies antivirales et/ou facteurs de restriction. L’un d’eux est un candidat prometteur de fonction inconnue et notre travail pourrait aider à le caractériser.

La tuberculose (TB) causée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est un problème majeur de santé publique dans le monde, y compris au Maroc ou l’incidence annuelle est de l’ordre de 1 pour 1000. Environ un quart de la population mondiale est infectée par Mtb, mais seule une minorité développe la tuberculose. Les études d’épidémiologie génétique suggèrent fortement que la tuberculose est aussi une maladie génétique. Les bases moléculaires de la TB ont été disséquées depuis les années 2000. Nous avons découvert deux types d’erreurs innées de l’immunité (IEI) aboutissant à la tuberculose, toutes deux altérant l’immunité liée à l’interféron (IFN)-γ: (i) des IEI rares, comme les défauts complets autosomiques récessifs d’IL-12Rβ1 et de TYK2, retrouvés chez quelques patients tuberculeux, et (ii) une IEI commune due à l’homozygotie pour le variant P1104A de TYK2 qui perturbe sélectivement l’immunité liée à l’IFN-γ, dépendante de l’IL-23, et qui représente jusqu’à 1% des cas de tuberculoses européens. Ces résultats ont fourni la preuve de principe qu’il existe à la fois des étiologies monogéniques rares et communes de la TB humaine, ils ont mis en évidence des variants spécifiques d’une origine ethnique (européen dans ce cas); ils ont établi que la production d’IFN-γ est essentielle pour l’immunité protectrice contre Mtb. Néanmoins, la grande majorité des patients tuberculeux n’ont pas d’étiologie génétique. Nous émettons l’hypothèse que la tuberculose est la conséquence d’IEIs monogéniques ou digéniques, encore à identifier, avec une pénétrance incomplète ou plus rarement complète, dans une proportion importante de la population. Pour découvrir ces variants, nous utiliserons une approche génome entier avec séquençage complet des exons et du génome si nécessaire. Les patients tuberculeux seront recrutés au Maroc, en particulier ceux appartenant à des familles consanguines et/ou multiplex (plusieurs atteints dans la famille) et/ou avec des formes récurrentes de tuberculose, car ces patients sont plus susceptibles d’être porteurs d’IEI. Notre projet suivra une stratégie combinant: (i) une étude génétique complète basée sur le séquençage de nouvelle génération de plus de 600 patients TB Marocains (dont 505 exomes déjà disponibles) et plus de 300 individus sains infectés pour rechercher des variants candidats à l’origine de la tuberculose à l’aide d’analyses de pointe testant différentes hypothèses génétiques (hétérogénéité ou homogénéité génétique, hérédité monogénique ou digénique), et (ii) des études fonctionnelles approfondies pour caractériser biochimiquement les effets des variants candidats nouvellement découverts, et pour valider immunologiquement leur rôle causal au niveau moléculaire et cellulaire. Notre projet bénéficiera également des patients TB précédemment recrutés d’autre origine (> 1000), afin de répliquer les résultats qui seront identifiés dans l’échantillon Marocain. Notre projet est très innovant et réalisable car il se base sur une collection unique de patients recrutés avec des critères d’inclusion rigoureux, une collaboration de longue date entre les partenaires Français et Marocains, et bénéficie des fortes compétences cliniques et génétiques des partenaires Marocains sur la TB et du partenaire Français dans la découverte de nouveaux IEI impliqués dans les maladies infectieuses. Nos données préliminaires indiquent que cette approche est fructueuse, car nous avons déjà identifié des mutations candidates très prometteuses, avec les variants gain de fonction mono-alléliques de STAT1 et des variants rares de perte de fonction bi-allélique dans LY9 et BTN3A3, et des variations mono- ou bi -alléliques communes de IL10RA. Notre recherche de variants rares et communes amenant à des IEI monogéniques ou digéniques qui contrôlent le développement de la TB à forte pénétrance permettra de déchiffrer les mécanismes de l’immunité protectrice contre Mtb chez l’homme. Cette approche ouvrira également la voie au développement de nouvelles approches préventives et thérapeutiques, visant à restaurer des réponses immunitaires déficientes, en particulier en rapport avec l’IFN-γ.

SAMHD1 est une triphosphohydrolase cellulaire (dNTPase) qui inhibe la réplication du VIH-1 dans les cellules immunitaires non cyclantes. Selon le modèle actuel, la fonction antivirale de SAMHD1 est basée sur sa capacité à hydrolyser les dNTP, ce qui entraîne une diminution de leur concentration en dessous du niveau requis pour une transcription inverse efficace.

SAMHD1 est une protéine ubiquitaire et stable. Pourtant, son activité anti-VIH-1 n’est observée que dans les cellules non cyclantes, suggérant l’implication de mécanismes de régulation post-traductionnels. Il est bien établi que dans les cellules qui se divisent et permissives au VIH-1, le résidu T592 de SAMHD1 est phosphorylé par les complexes cycline-CDK. En revanche, ce résidu est déphosphorylé dans des cellules non cyclantes réfractaires à l’infection. De plus, un mutant phosphomimétique de SAMHD1 est incapable d’inhiber le VIH-1. Sur la base de ces observations il a été proposé que la phosphorylation de T592 inactive la restriction médiée par SAMHD1. De manière surprenante, un nombre croissant de preuves indique que cette modification n’influence pas l’activité dNTPase. Ainsi, outre l’épuisement du dNTP, le mécanisme de restriction de SAMHD1 semble nécessiter d’autres fonctions régulées par la phosphorylation de T592 et / ou d’autres modifications post-traductionnelles.

Des travaux récents de notre équipe ont confirmé que le contrôle de l’activité antivirale SAMHD1 implique également la SUMOylation du résidu K595. Comme le mutant phosphomimétique, les variants de SAMHD1 qui ne peuvent pas être SUMOylés sur K595 ont une activité antivirale défectueuse, mais une fonction dNTPase intacte (manuscrit en révision à Nature Communications).

Afin de définir quels sont les mécanismes moléculaires de la restriction de SAMHD1 indépendants de son activité dNTPase, et régulés par la phosphorylation de la T592 et/ou la SUMOylation de la K595 nous développerons les axes de recherche suivantes :

1- Caractériser les conséquences de la phosphorylation de T592 et/ou de la SUMOylation de K595 sur la dynamique de la réplication virale

2- Définir le rôle de l’interaction entre SAMHD1 et les acides nucléiques dans la restriction du VIH-1 et étudier si et comment les MPTs influencent cette association ;

3- Etudier l’implication cofacteurs viraux et/ou cellulaires dans le mécanisme de restriction de SAMHD1.

Ces connaissances seront nécessaires pour pouvoir envisager des stratégies visant à manipuler spécifiquement l’activité antivirale de SAMHD1 sans modifier ses autres fonctions cellulaires.