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L’importance de la modulation du métabolisme central du carbone (CCM) dans l’activation des cellules immunitaires a été établi. Cependant, l’impact de cette modulation par les virus sur la réponse innée des cellules infectées et des cellules immunitaires du microenvironnement reste largement inconnu. Lors de l’hépatite C chronique, l’inflammation du foie de bas grade et la stéatohépatite contribuent à la fibrose et au développement du carcinome hépatocellulaire (CHC). Le VHC induit la glycolyse et réoriente le métabolisme hépatocytaire vers la lipogenèse nécessaire à sa réplication mais favorise également la stéatohépatite. La façon dont cette reprogrammation métabolique affecte la réponse immunitaire innée est mal comprise.

Dans ce projet, nous étudierons comment la protéine NS5A du VHC, reprogramme le CCM en ciblant la glycolyse et interfère avec l’immunité innée et les signaux inflammatoires à la fois dans les hépatocytes et les cellules immunitaires de proximité, telles que les cellules NK, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs). Nos travaux antérieurs ont montré l’impact du métabolisme des hépatocytes sur l’activation de l’immunité innée (Perrin-Cocon et al. Commun.Biol., 2021). Nous avons récemment découvert que le domaine 2 de NS5A (NS5A-D2) est un activateur allostérique de GCK, l’hexokinase spécifique du foie qui contrôle de la glycolyse. NS5A-D2 seule reprogramme le CCM vers un phénotype plus glycolytique et lipogénique, ce qui correspond aux besoins réplicatifs du VHC (Perrin-Cocon et al. IJMS, 2022). Des données préliminaires indiquent que la NS5A-D2 induit l’IL-8, plusieurs enzymes impliquées dans la synthèse des eicosanoïdes et la sécrétion de lipoprotéines. De plus, dans des cultures organotypiques de foie de souris (OLiCs), nous avons observé que l’expression de NS5A-D2 induit l’IFNγ, une cytokine sécrétée par les cellules NK dans le foie. Ceci suggère que la reprogrammation métabolique induite par NS5A-D2 dans les hépatocytes, à travers la sécrétion de cytokines, d’eicosanoïdes et de lipoprotéines, pourrait avoir un impact sur le recrutement, l’activation et la fonctionnalité des cellules immunitaires dans le foie.

Notre premier objectif est de caractériser l’impact de NS5A-D2 sur le CCM et le lipidome en utilisant des approches métabolomiques. Nous testerons l’effet de l’expression de NS5A-D2 sur l’induction de l’immunité innée dans les hépatocytes. Nous ciblerons les voies métaboliques activées par NS5A-D2 en utilisant des inhibiteurs, des siRNA et la surexpression d’enzymes pour restaurer une réponse immunitaire normale dans les hépatocytes et comprendre comment la reprogrammation métabolique associée à l’expression de NS5A-D2 module l’immunité innée. Ceci sera fait dans un premier temps dans des cellules hépatocytaires exprimant GCK, développé par l’équipe A, et ensuite validé dans des PHH. Le second objectif de ce projet est d’analyser les conséquences fonctionnelles de la reprogrammation métabolique induite par NS5A sur la fonction des cellules immunitaires infiltrant le foie. Nous cocultiverons des hépatocytes exprimant ou non NS5A-D2 avec des cellules NK, des macrophages ou des DCs, et suivrons l’activation de ces cellules immunitaires en utilisant des méthodes d’immunologie standard. Nous analyserons la contribution des facteurs solubles, notamment les lipides altérés et les eicosanoïdes induits par NS5A-D2, dans ce cross-talk. Enfin, nous utiliserons les OLiCs développées par l’équipe B pour étudier l’effet de l’expression de NS5A-D2 dans un système intégré. Dans ce dernier modèle, qui maintient les populations cellulaires et l’intégrité du tissu hépatique, nous déterminerons l’impact de l’expression de NS5A-D2 sur l’activité les cellules immunitaires résidentes du foie.

En résumé, ce projet vise à améliorer notre compréhension de la pathogenèse de l’hépatite virale chronique, mais aussi à comprendre l’interaction entre reprogrammation métabolique et immunité innée dans le foie. Ces travaux devraient permettre d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour combattre la stéatohépatite et l’inflammation chronique, et ultimement pour prévenir le développement du CHC.

Dans le monde, 115 millions de personnes sont infectées par le virus de l’hépatite C (VHC), dont 80% sont atteints d’une infection chronique. En outre, le fardeau du VHC est porté essentiellement par les pays à ressources limitées. L’arrivée des antiviraux à action directe (AAD) en 2014 rend possible l’objectif d’élimination du VHC.

Le Vietnam est l’un des pays avec la plus forte prévalence du VHC, celle-ci étant particulièrement élevée chez les patients infectés par le VIH et chez les usagers de drogues injectables (UDI). Il reste des obstacles pour l’accès aux outils diagnostics et au traitement dans certains contextes. Toutefois, avec la contribution du Fonds Mondial, l’accès aux AAD est gratuite pour les patients coinfectés par le VIH et le VHC, mais uniquement dans certains sites cliniques présélectionnés. Le projet MOVIDA Hep 2 (financé par l’ANRS-MIE) est une étude de cohorte implémentée au Nord du Vietnam, évaluant l’accès au traitement par DAA chez les patients coinfectés par le VIH et le VHC, et utilisant les prélèvements de sang sur papier buvard (DBS ou dried blood spots) pour permettre la mesure de la charge virale VHC en routine. L’objectif principal de l’étude MOVIDA Hep 2 est de comparer la compliance au traitement par AAD entre les sujets qui sont suivis dans les sites cliniques avec et sans accès aux AAD.

Le succès du traitement par AAD nécessite une bonne compliance aux soins et une bonne observance au traitement, ainsi que l’adoption de mesures de prévention pour éviter la réinfection par le VHC. Les études récentes en science sociale ont porté sur le cout et les bénéfices du traitement du VHC, et sur l’évaluation de modèles d’intégration des soins pour les UDI. Peu d’étude qualitative ont exploré les programmes implémentés en zones rurales décentralisées au Vietnam. 

La présente étude est l’opportunité d’ajouter une composante qualitative au projet MOVIDA Hep 2 afin de mieux appréhender l’expérience et la perception des soins et du traitement du VHC par une population coinfectée par le VIH et le VHC en zone décentralisée au Vietnam. Une meilleure compréhension des relations synergiques entre la perception de la maladie (hépatite C, les comorbidités, le VIH), le corps et la guérison peut aider à la préparation ou amélioration des programmes d’accès aux soins et au traitement contre le VHC dans ce contexte au Vietnam, où l’accès aux soins peut rester difficile. Cette évaluation qualitative ne s’intéressera pas seulement aux patients, mais aussi au personnel médical pour mieux comprendre comment les soins du VHC a modifié leurs activités, et possiblement comment mieux intégrer ces activités dans leur quotidien.

L’hépatite B chronique (HBC) est un problème majeur de santé publique affectant 300 millions d’individus de par le monde et est la cause majeure de l’insuffisance hépatique, de la cirrhose et du carcinome hépatocellulaire. En raison de la persistance de l’ADN circulaire clos de façon covalente (ADNccc) du virus de l’hépatite B (VHB), une guérison complète par les traitements actuels n’est pas possible. De nouvelles stratégies sont requises pour le traitement du VHB, incluant l’identification de biomarqueurs sériques représentatifs de l’activité de la molécule d’ADNccc intrahépatique, afin d’améliorer la prise en charge des patients et le développement de nouveaux traitements antiviraux. De nombreuses données convergent vers l’idée que les ARN circulant du VHB (cirB-ARN) pourraient servir de biomarqueurs sériques de l’infection par le VHB, de son traitement et de son pronostic. En revanche, la nature de ces ARNs et des particules les contenant in vivo et in vitro font actuellement l’objet de débat.

            Ce projet, destiné à financer la thèse de doctorat associée, ambitionne de profiler les protéines associées aux vésicules extracellulaires sécrétées dans des hépatocytes infectés ou non par le VHB, dans des échantillons de patients chroniquement infectés, et d’évaluer l’effet de traitements par analogues de nucléot(s)ides sur le protéome sécrété. Cela permettra la génération d’un jeu de donnée sans précédent qui orientera le choix de protéines cibles pour une analyse mécanistique en profondeur. Une meilleure connaissance des mécanismes contrôlant la sécrétion des ARNs d’HBV selon les phases de l’hépatite B chronique aidera à comprendre la valeur diagnostique du biomarqueur et participera au développement d’outils de diagnostic dédiés.

Contexte

L’histoplasmose, la talaromycose et la cryptococcose sont des infections fongiques invasives (IFI) graves chez les patients vivants avec le VIH à un stade avancé. Bien que ces agents pathogènes soient probablement endémiques au Cambodge, peu ou pas de données sont disponibles, en particulier pour l’histoplasmose et la talaromycose. La méconnaissance de ces infections et la disponibilité insuffisante de méthodes diagnostiques fiables conduisent à un retard de diagnostic et donc de traitement spécifique, responsable d’une mobi-mortalité excessive. Ces dernières années, les méthodes antigéniques et moléculaires sont apparues comme des outils prometteurs pour le diagnostic rapide des infections fongiques invasives. Notre objectif principal est d’évaluer, à l’aide de ces nouvelles méthodes, la prévalence de ces infections chez les patients atteints d’une maladie VIH avancée au Cambodge. Ce travail de recherche sera associé à un renforcement des capacités cambodgiennes en termes de transfert de compétence d’outils diagnostic simple des IFI et de formations clinique des acteurs de soins locaux sur les IFI.

Méthodes

C’est une étude rétrospective avec analyses sur une biobanque. Nous utiliserons les échantillons de l’étude STATIS, une étude sur la prise en charge diagnostique de la tuberculose menée chez 199 patients cambodgiens vivants avec le VIH avec des avancé (lymphocytes T CD4+ <100/mm3). Nous réaliserons d’abord des tests antigéniques spécifiques pour chaque pathogène. Comme la réactivité croisée de ces tests entre l’histoplasmose et la talaromycose est inconnue, nous confirmerons les résultats positifs par une PCR quantitative spécifique. Nous organiserons un atelier de formation au laboratoire pour initier l’équipe à l’utilisation du test et pour mettre en place un programme de formation, ainsi qu’un atelier de formation clinique pour les cliniciens en charge de patients à risque de mycoses invasives dans les hôpitaux de Phnom Penh.

Résultats attendus et perspectives

Ce projet fournira les premières données sur la prévalence de l’histoplasmose et de la talaromycose chez les patients vivants avec le VIH à un stade avancé au Cambodge. Cette étude permettra également de sensibiliser les acteurs locaux à ces diagnostics différentiels de la tuberculose ainsi qu’à l’existence de coinfections. La formation des équipes locales aux nouvelles méthodes diagnostiques permettra de poursuivre les recherches sur ce problème de santé publique, notamment par des études prospectives sur les infections fongiques invasives au Cambodge.

Les rétrovirus humains HTLV-1 et HIV-1 possèdent la particularité de se transmettre de façon très efficace par contacts entre les cellules infectées productrices de virus et les cellules cibles. Ce mécanisme reste un processus mal connu, alors qu’il est non négligeable dans le cycle des rétrovirus. En effet, il permet (i) d’éviter ou de limiter la neutralisation par le système immunitaire et (ii) de réduire la vitesse de diffusion du virus dans les milieux extracellulaires avant l’attachement aux cellules cibles et (iii) augmente la quantité de virus délivré dans les cellules cibles. De plus, ce processus de transmission virale échappe aux mécanismes de restriction cellulaires ainsi qu’à l’action des antiviraux. Il est donc crucial de mieux caractériser la transmission virale après contact cellulaire pour pouvoir mieux contrôler la dissémination virale.

Trois voies de transfert des particules virales ont été décrites pour les rétrovirus HIV-1 et HTLV-1 : (i) la synapse virologique, (ii) la formation de conduits intercellulaires et (iii) le transfert de particules virales stockées au niveau d’agrégats extracellulaires adhésifs à la surface des cellules infectées, ou biofilms viraux. Des études récentes montrent que le biofilm viral est polarisé, et que le maintien de cette polarité est déterminant pour l’infection des cellules cibles lors du contact cellule-cellule. Les protéines cellulaires responsables du maintien de cette polarisation et leur implication dans l’assemblage des virions et leur transfert aux cellules cibles ne sont pas totalement identifiées, ni pour les biofilm de HTLV-1 ni pour ceux de HIV-1 décrits plus récemment. Lors d’un précèdent projet financé par l’ANRS, nous avons identifié que la tétraspanine CD82 et la cavéoline sont responsables du maintien de la polarisation du biofilm de HTLV-1 et de sa capacité infectieuse. Pour HIV-1, seul le collagène a été identifié comme important pour le maintien de la polarisation. Nous souhaitons donc dans ce projet de recherche poursuivre la caractérisation des biofilms de HIV-1 et HTLV-1 afin d’identifier les constituants cellulaires responsables des plateformes polarisées d’assemblage des virions et déterminer comment ces plateformes macromoléculaires participent à la transmission virale. En réalisant ces études en parallèle sur des cellules infectées par HIV-1 et par HTLV-1, nous pourrons comparer la structure, la composition moléculaire, les propriétés physiques des biofilms rétroviraux et identifier les mécanismes moléculaires responsables de la transmission des biofilms HTLV-1 et HIV-1 à l’infection des lymphocytes T CD4 cibles.

Nous utiliserons pour cela des approches innovantes d’imagerie de pointe, (microscopie à fluorescence haute résolution, microscopie à force atomique, microscopie électronique à balayage) combinées à des techniques de virologie moléculaire (modification des protéines virales) et de biologie cellulaire (invalidation génétique des constituants des biofilms, analyse des complexes macromoléculaires, mesure de la transmission virale).

Nous anticipons que nos résultats permettront des avancées majeures dans la compréhension des mécanismes de transmission virale par contact cellulaires, tout comme l’a été la découverte pionnière de la synapse virologique formée par les cellules infectées par HTLV-1, mécanisme ensuite également démontré comme responsable de la transmission de HIV-1 par contact cellulaire. A plus long terme, nos résultats pourront ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques en ciblant par exemple les voies de biogénèse des biofilms, leur mobilité à la surface des cellules infectées ou les composants (protéiques ou lipidiques) responsables de leur transmission d’une cellule infectée à sa cible.